| 研究課題/領域番号 |
15K10410
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
河村 一郎 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員准教授 (90535832)
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| 研究分担者 |
前田 真吾 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (60353463)
小宮 節郎 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (30178371)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脊柱後縦靭帯骨化症 / 骨芽細胞 / 軟骨細胞 / 靭帯細胞 |
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| 研究実績の概要 |
引き続き、マウス脊柱後縦靭帯採取の条件検討を行った。しかし、やはりマクロ的にマウス脊柱後縦靭帯の同定が困難で、かつ靭帯組織は基質タンパクに富み細胞成分に乏しいことから、やはり満足いくレベルのmRNA採取には至らなかった。ここで一旦研究におけるマウス後縦靭帯の意義づけを再検討した。すなわち、直立歩行のヒトと4足歩行のマウスでは、脊柱にかかる力学的ストレスが根本から異なること、遺伝学的・進化論的にもヒトとマウスは大きな隔たりがあること、野生型マウスの自然発症OPLLは確認されていないことから、やはりヒトのゲノムワイド関連解析(GWAS)研究から得られた情報に立ち戻る事が責任遺伝子道程への近道と判断した。
そこで、GWAS疾患感受性ゲノム領域から候補遺伝子を選んでOPLL組織における発現を、免疫組織化学染色で検討を開始した。また、同時に候補遺伝子のsiRNAを用いて、靭帯細胞(繊維芽細胞)における軟骨細胞分化と脱分化における影響を検討した。NIH-3T3細胞と、マウス脊柱靭帯初代培養細胞において、候補遺伝子のsiRNAによるノックダウンによる影響を、BMP、TGF-β、インシュリン等の軟骨細胞分化誘導刺激の有無で比較検討した。qRT-PCRにより、上述の軟骨細胞マーカーや繊維芽細胞マーカー、MSCマーカーを検討した。内軟骨性骨化を経ずに直接膜性骨化様表現型を示す可能性も十分にあるので、骨芽細胞マーカー(Runx2, Sp7, Alp, Bsp, Ocn等)も検討した。適宜基質染色(アルシアン・ブルー染色やALP染色、von Kossa染色等)も導入し、石灰化も含めて表現型を評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウスの後縦靭帯採取に難渋したために、同組織特異的遺伝子の採取ができていない。しかし、研究の意義について再検討した結果、マウスの後縦靭帯特異的な遺伝子が同定できたとしても、野生型マウスに自然発症OPLLが確認されていない以上は、その遺伝子とOPLLを理論的に結びつけるのは困難なので、ヒトGWASの結果に立ち返る事とし、より臨床に近い研究を進める事が出来ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトOPLLにおける候補遺伝子の発現と機能解析について、ヒト頸椎OPLL組織と、対照のヒト頸椎椎間板ヘルニア手術症例の後縦靭帯組織と比較しながら、遺伝子のコード蛋白について発現分布が、正常靭帯から変性し始める場所なのか、繊維軟骨様組織に発現するのか、あるいは骨化部に近接して局在するか、免疫染色で調べる。数は１０例ずつを目標にする。この際、特に対照例においてはtrans-differentiationの兆候も含めて、年齢と性差における発現強度と分布の違いにも注目する。組織学的検討の他、一部はmRNA抽出に供し、qRT-PCR法にて免疫染色データを再現する。入手可能な抗体が免疫染色に耐えない場合も考えられ、mRNA発現確認はこの場合必須となる。さらに一部は初代培養細胞樹立に供し、抽出遺伝子のノックダウンと強制発現実験を行い、靭帯の内軟骨性骨化への影響を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
残額は29732円であり概ね計画通りに予算を執行出来ているが、抗体などの購入には足りない額なので、次年度に繰り越して有効に使用する事とした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
残額は、抗体購入などに有効に充てたい。
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