研究課題
本課題について、前年度までに、グルタチオンに関連する破骨細胞分化関連候補分子Aを見出している。また、in vitroおよびin vivoで候補分子の機能を明らかにするために、ゲノム編集技術によるノックアウトマウス作製法の確立を行なってきた。本年度では、グルタチオンに関連する破骨細胞分化関連候補分子Aに加え、候補分子Bを新たに見出した。PCRによりこれらの分子が破骨細胞に発現していることを明らかにした。次に、CRISPR-Cas9 systemを用いて、これら分子のノックアウトマウスの作製を試みた。分子Aについては、PX458ベクターにターゲット配列をクローニング後、これを鋳型としてin vitro transcrptionにてgRNAを合成した。分子Bについては、crRNAおよびtracrRNAをオリゴRNA合成により取得し、アニーリングによりgRNAを調整した。エレクトロポレーションにより、マウス受精卵にCas9 proteinとgRNAを導入後、2細胞期胚を偽妊娠マウスに移植した。得られたF0マウスをジェノタイピングした結果、A,Bいずれの遺伝子も、ゲノム編集が行われていた。これらマウスと野生型マウスを交配させることによりF1マウスの作出を試みたところ、分子AについてはF1マウスが得られた。しかし、分子BについてはF1マウスは得られなかった。分子Aの遺伝子はX染色体上に位置するため、オスF1の一部はノックアウトマウスであった。現在、この個体を用いて破骨細胞の分化および骨吸収能について解析を進めている。
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