| 研究課題/領域番号 |
15K10481
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
木下 晃 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 講師 (60372778)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | カムラチ・エンゲルマン病 / TGF-β1 / iPS細胞 / CRISPR/Cas9法 |
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| 研究実績の概要 |
カムラチ・エンゲルマン病（Camurati-Engelmann disease、以下CAENDと略す．OMIM: #131300)は非常に稀な常染色体優性遺伝形式の骨系統疾患である.報告者らが行った疫学調査により、本邦における患者数は50-60名程度と推測されている.CAEND患者では、頭蓋骨や長管骨において過剰な膜内骨化が起きており、この過剰な膜内骨化により、骨皮質肥厚および長管骨骨幹部の紡錘形肥大を引き起こす.加えて四肢の骨痛、筋力低下、易疲労性がこの疾患の特徴である.またステロイドホルモンの投与による対症療法が唯一の治療法であり、治療法の開発が急がれている.
報告者らは、CAENDはtransforming growth factor-β1（TGF-β1）遺伝子が責任遺伝子であることを報告した.TGF-β1は、活性ドメイン、その機能を抑制するlatency associated peptide (LAP)ドメイン、シグナルドメインの３つのドメインから構成されている. TGF-β1は活性を持たない潜在型として骨基質に存在しているが、CAEND患者では変異により容易に活性化して、血中に遊離していくと考えられている.
報告者はCAENDモデルとして、患者で同定された変異をノックインしたマウスの作製を試みたが、ジーンターゲティング法やCRISPR/Cas9法による変異のノックインは失敗した.本研究では、CAEND患者由来の血球細胞から作製したiPS細胞を用いて、治療法の開発を目指す.
遺伝的バックグラウンドの違いが、CAEND患者間での表現系の差を引き起こすため、まず患者由来iPS細胞からCRISPR/Cas9法で変異だけを除き、遺伝的バックグラウンドが完全に一致したコントロール細胞を樹立する.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
報告者は、CAENDは「TGF-β1の変異が引き起こす過剰なTGF シグナルによる細胞の自己増殖能の亢進と分化抑制がその発症原因である」と考えており、まずこの仮説を証明した後に、治療法の開発を目指す.
CAEND研究において問題になることは、CAEND患者間での表現系の差異が非常に大きいことである.同じCAEND家系内でも、重・軽症度は大きく異なる.これはTGF-β1変異以外の遺伝的背景の効果が大きいためと考えられる.本研究においても、この点を改善する必要がある.研究に利用可能な健常人由来iPS細胞（正常コントロール）に加えて、患者iPS細胞からTGF-β1変異だけを除いた遺伝的背景を全く同一にしたiPS細胞の作製を行う.以前は不可能であったが、新規ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9法を利用することで可能になった.変異だけを除去する目的のため、①４種類のguide RNA (gRNA)をin vitro合成し、Cas9タンパク質存在下で、標的配列を最も効率的に切断可能なgRNAを選抜した.②細胞の選択に必要なピューロマイシン耐性遺伝子とgreen fluorescence protein (GFP)を含むPiggy-Bacベクターに組換えに必要なTGFB1遺伝子断片をクローニングしたノックインベクターを作製した.③予備試験として、HEK293T細胞にgRNA、Cas9タンパク質、ノックインベクターを同時にトランスフェクションし、組換え体を作製した.
新規CAEND患者の変異解析を行ったが、TGF-β1には変異が同定されなかった.エキソーム解析で網羅的な変異解析を行う.
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| 今後の研究の推進方策 |
新規ゲノム編集システム・CRISPR/Cas9法を用いて、CAEND患者由来iPS細胞からTGF-β1変異のみを除去することから研究を開始したが、CRISPR/Cas9法はまだ発展途上の技術であり、手探りで研究を行っている状況である.特に世界的に利用されているgRNA・Cas9を同時発現するベクターには、ピューロマイシン耐性遺伝子に変異が導入されており、薬剤選択が効かないなど問題が多く、この変異を除くなど余計な時間を浪費してしまった.
予備実験では、高い導入効率と速い分裂速度をもつHEK293T細胞に、切断効率の高いgRNA、Cas9タンパク質、ノックインベクター(Piggy-Bacベクター)をトランスフェクションし、ピューロマイシン選択によりノックイン組換え体を得ることができた.今後は実際に患者由来iPS細胞でのゲノム編集を行う.その際には、HEK293Tよりも導入効率が落ちるヒトiPS細胞への導入効率が問題になるかもしれないため、最も優れた導入方法を探す必要がある.
またCAEND患者由来iPS細胞は、通常のiPS細胞の培養条件下では未分化な状態を維持させることが困難である.原因はまだ不明だが、異常なTGFシグナルが原因であると想像される.TGFシグナル阻害剤の使用などが必要である.
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２７年度に使用した消耗品（ベクター等）は以前購入したもので、新規に購入する必要がなかった。所属教室がAMEDより研究費を獲得しており、この研究費を優先的に使用したためである.
iPS細胞研究に必要な消耗品はどれも高額で、まとまった金額の出費が必要なため次年度に繰り越した.
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２７年度の次年度使用額と今年度の予算を合わせて、iPS細胞の培養に必要な試薬・培地などの消耗品、小額備品を購入する。謝金および人件費としての支出予定はない.
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