| 研究課題/領域番号 |
15K10489
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
内山 勝文 北里大学, 医学部, 准教授 (90286310)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 人工関節 / 感染 / 迅速細菌遺伝子検査 / PCRラテラルフロー法 / 16S-rRNA / シーケンス解析 |
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| 研究実績の概要 |
人工関節術後細菌感染の術中の迅速細菌遺伝子検査の運用を目的に、PCRラテラルフロー法(PCR-LF法)でブドウ球菌系3菌種(黄色ブドウ球菌：SA、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌：MRSA)の検出を試みた。同時に臨床データや経過、関節液検査(細胞数、糖、CRP値など)、病理組織像から診断した感染陽性例と判断した検体の一般細菌培養検査結果と比較したところ、PCR-LF法の検出感度が高かった。しかし、この結果は臨床的に問題ない死菌の核酸を増幅している可能性も考えられたため Propidium monoazige (PMA)を用いたMRSA IIの死菌・生菌の分別判定を行い、希釈感度試験で菌量が10の4乗 CFU/ml以上、混合試験より死菌と生菌が10の2乗 CFU/ml以上の菌量の差がないと分別することが出来なかったため、臨床応用が困難と考えている。
ブドウ球菌系3菌種以外は、16SリボゾームRNA陽性例に対して、シーケンス解析による起炎菌の推定を試みたが、増幅酵素由来の大腸菌や試薬中の他の細菌によるコンタミネーションが発生し検出感度に問題が発生した。そのために真核細胞由来のeukaryote-made thermostable DNA (Taq) polymerase (e-Taq)を用いることにより術中材料より直接、10の2乗 CFU/mlまで細菌DNAの検出が可能となった。従来のPCR酵素を用いた材料からの細菌遺伝子検査より、e-Taq法からの検出率は2.8倍高くシーケンス解析にて20菌種の推定が可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PCR-LF法においてはグラム陽性菌11種類、グラム陰性菌9種類の細菌、16S-rRNA遺伝子MRSA、ESBLの同時スクリーニングに対応するオリジナル特異的プローブの開発が遅れている。しかしこれまでの検討より、PCR-LF法とe-Taq酵素を用いたシーケンス解析を人工関節術後感染の菌種検索に導入することは可能であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
更なる迅速化・簡便化には核酸増幅時間の短縮が可能なHyperPCR装置の導入や、抗菌薬の選択の補助となるPCR-LF法の菌推定システム（グラム陽性菌11種類、グラム陰性菌9種類の細菌、16S-rRNA遺伝子MRSA、ESBLの同時スクリーニングに対応するオリジナル特異的プローブの開発）の構築が早急の課題である。e-Taq酵素が今後市販される予定であり、オリジナル特異的プローブの開発も進展することが期待できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度の研究費使用状況はおおむね予定した申請額が使用されていた。残金は38,806円であり、無理には使用せず次年度に繰り越しした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在、無償で試験使用させていただいている酵素が市販されることに伴い、酵素の購入費の計上が多くなることが予測される。頻繁な学会報告や論文の作成も開始することが考えられ、論文の校正費や投稿料の計上も必要である。
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