研究課題/領域番号 |
15K10492
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研究機関 | 慶應義塾大学 |
研究代表者 |
二木 康夫 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10276298)
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研究分担者 |
福原 悠介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (60594645)
宇田川 和彦 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70528364)
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研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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キーワード | メカニカルストレス / 三次元軟骨モデル / IL-1 / TRPV4 |
研究実績の概要 |
1)ATDC5を用いた三次元培養軟骨モデルの構築とメカニカルストレスの影響:昨年度に作成した三次元軟骨モデルを使用した。Alginate beads培養を行い、コラーゲンスキャフォールド(アテロコラーゲンスポンジ MIGHTY, KOKEN)に細胞を播種させた。そこに力学負荷培養装置(CLS、テクノビュー)を用いて、繰返し力学負荷(40kPa、0.5Hzで3時間)を加え、培養上清中のPGE2とreal-time PCRにてADAMTS4の発現が有意に増加した。 2)メカニカルストレスとIL-1Rシグナル、TRPV4との関連:上記のモデルにメカニカルストレスをかけることで、IL-1Rの有意な発現上昇を認めた。また微量のIL-1βを添加して力学負荷をかけると、添加のみでは上昇しない濃度でADAMTS4とIL-1Rの有意な発現の上昇を認めた。さらにメカノレセプターであるTRPV4との関連を検討するために、TRPV4 agonistであるGSK1016790A(GSK)とantagonistであるHC-067047(HC)を添加して、それぞれの発現の関連性を検討した。ADAMTS4はGSK刺激により抑制され、ADAMTS4とIL-1R はHC刺激によりさらに上昇を認めた。ATDC5においてメカニカルストレスによりTRPV4を介してADAMTS4およびIL-1Rの発現が亢進した。 3) IL-1R KOマウスを用いたOAモデルの作成:OAモデルとしてマウスのDMMモデルを使用する。8週齢雄のIL-1R KOマウスにDMMモデルを作成した。術後8週時に病理組織学的検討を行い、OAの程度をスコアリングしWTと比較する予定である。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
三次元培養軟骨モデルの作成し、IL-1シグナルとメカニカルストレスとの関連について、TRPV4に着目し実験を重ねており、さらに検討を続ける予定である。
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今後の研究の推進方策 |
1)KOマウスを用いたOAモデルの作成 IL-1R KOでのOAモデルの作成を行っているが、作成数がまだ少なく今後も継続予定である。またIL-1αβ KO、MyD88 KOマウスでのOAモデルの作成も検討予定である。 2)メカニカルストレスのケミカルシグナルへの変換点の検討 今回の検討で、メカニカルストレスに微量なIL-1シグナルが加わることが、catabolicに影響し、さらにTRPV4が関与していると考えられた。今後は三次元軟骨モデルにメカニカルストレスを加え、IL-1R、TLR4の下流で働く分子であるIRAK4、TRF、TRIF、MyD88などを、siRNAの手法でそれらの分子の発現を減弱させた場合、MMP-3、ADAMTS4の発現の変化を確認しし、dominantなシグナルを絞り込む。またさらにTRPV4 agonist、antagonistを使用し、IL-1Rシグナルとの関連を追及していく。
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次年度使用額が生じた理由 |
H28年度の使用額については予定の範囲での使用となった。H27年度で試薬購入やスキャフォールドの使用で予定よりも支出を抑えることができた分については、今後のKOマウスの飼育、繁殖(最後に一括支払いの予定)、siRNAを含めた試薬購入に使用できると考えられる。
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次年度使用額の使用計画 |
OA(DMM)モデルを作成のためのIL-1R KOマウスの繁殖、維持。軟骨細胞の三次元培養ならびにIL-1Rシグナル、TRPV4との関連の解析のためPCR用のプライマー、試薬購入、タンパクレベルの分析のためウェスタンブロットまたはELISAのための抗体の購入または作製、研究結果を海外学会で発表するための渡航費等を予定している。
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