| 研究課題/領域番号 |
15K10510
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
西脇 公俊 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10189326)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 肺水腫 / 肺動脈血管内皮細胞 / 神経ペプチドY / イソフルラン / セボフルラン |
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| 研究実績の概要 |
肺動脈血管内皮細胞層における透過性亢進作用を検討する試験系として、下部に1 μmの孔を持つ膜のついたインターセル内に細胞を播種し、3日間培養後にインターセル内に薬物と共に蛍光物質FITCで標識されたアルブミンを添加して、反応終了後にインターセル外側ウェル中培地の蛍光強度を測定する方法を確立している。この系を用いてLipopolysaccharideや血管内皮細胞成長因子（VEGF）など、数種の既報の血管内皮細胞透過性亢進物質の作用を検討したところ、全てで報告どおりの有意な透過性亢進作用が認められた。しかし、肺水腫発症に関与すると考える神経ペプチドY（NPY）をはじめ、いくつかの麻酔薬には、この系での有意な細胞透過性亢進作用は認められなかった。一つの要因として、細胞間の隙間を大きくする作用が小さい場合、分子量が大きいFITC標識アルブミン（分子量66 kDaのアルブミン1モルに分子量389.4のFITCが7-12モル結合）の通過が妨げられるため、透過性亢進作用が弱い物質の効果は検出が難しくなっているのではないかと考えた。そこで、未検討であった吸入麻酔薬のIsoflurane（2%）とSevoflurane（3%）の作用をこれまでの試験系で検討すると同時に、アルブミンの結合していないFITCを用いたアッセイ系でも同薬剤の評価を行うことにした。薬剤の反応時間を8時間まで検討したが、2種の吸入麻酔薬はどちら系においても有意な細胞透過性亢進作用を示さなかった。アッセイの際にコントロールとなる細胞単層バリアーに対するFITCおよびFITC標識アルブミンの8時間後における透過率はそれぞれ、58-70%と25-34%で、使用する蛍光物質の分子量の違いが透過率に反映することを確認し、FITCを使用する系が既存のものとは検出感度の異なるアッセイ系として使用できる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
揮発性吸入麻酔薬を用いた検討は、これまでのペプチドや薬剤のように培地へ直接添加するのではなく、チャンバー内で細胞系にガスを暴露させる方法であったため、麻酔機器の準備から実際の運用、安定した暴露条件の設定に時間を要した。しかしながら、吸入麻酔薬の作用を細胞レベルで評価できる環境を整えることができた。検出感度の異なるin vitro肺血管内皮細胞モデル系を追加できたことと併せて、今後研究を進めるにおいて有益であると考える。
上記に加え、現在検討途中段階にある血管平滑筋細胞を用いたNPY誘発VEGF産生量の測定試験を先行して行なったため、当初の優先検討課題であった「ラット脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わるneuropeptidesの同定とVEGFの関与」に着手できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで着手できていなかったin vivoにおける検討課題「ラット脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わるneuropeptidesの同定とVEGFの関与」について、ラット第四脳室への生理食塩水注入による脳死モデルの作製から検討を開始する。生理食塩水注入後から6時間にわたり血液ガス分析による肺障害を評価するとともに、血液を採取しNPYなどの神経ペプチド含量を測定する。その後、気管支肺胞洗浄を行ない、肺を摘出する。肺のWet/Dry Ratio、肺組織中の神経ペプチド含量の測定を行い、肺水腫発生と神経ペプチドとの関連を探る。
また、in vivoでの検討として、FITCを用いた細胞透過性アッセイ系でNPY単独およびノルエピネフリン共存下での作用の有無を検討する。そこでNPYに細胞透過性亢進作用が見られた場合は、細胞内シグナル阻害剤を用い、細胞透過性亢進メカニズムを詳細に解明していく。
次年度使用額が生じた理由と研究計画
理由： 肺動脈血管内皮細胞を用いたin vitroの細胞透過性アッセイに時間を要し、初年度に予定していたin vivoラット脳死モデルを用いた検討に着手できなかったことが最大の理由である。
使用計画：当初の計画通り、in vivoラット脳死モデルを用いた検討を行う。in vitroの細胞透過性アッセイを継続して行なう他、神経ペプチド添加後の培養細胞内カルシウムの変動および細胞間隙形態変化の観察を行なう。
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