| 研究課題/領域番号 |
15K10512
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
澁田 達史 国際医療福祉大学, 医学部, 教授 (20324767)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 静脈麻酔薬 / 神経毒性 / 発達脳 / 培養神経細胞 / カルシウムイメージング |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、従前より施行し、蓄積された実験データの解析処理を行い、国際学会を含む4件の学会発表を行い、論文作成、英文校正、投稿を行った。
小児における麻酔薬の神経毒性は、現在、麻酔科医をはじめとする医療関係者のみならず広く社会的にも大きな問題とされ関心を集めている。我々は、ウイスターラット胎児大脳皮質神経細胞より初代培養を行い、チオペンタール(TPS), ミダゾラム（MDZ）, プロポフォール(PPF)をそれぞれ培養日数（DIV）の異なるラット初代培養大脳皮質神経細胞に投与し、細胞死に到る様子を形態学的手法により調べ、さらに麻酔薬を投与した際の神経細胞内カルシウム濃度（[Ca2 +]i）上昇をZeiss Axiovert 200, Hamamatu photo C8214, ORCA-ERを用いて測定し、アクアコスモス(浜松フォトニクス)にて解析を行うカルシウムイメージング法によって調べることにより、臨床使用濃度における中枢神経の発達に伴う麻酔薬の神経毒性の経時的変化を調べた。
これらの実験とデータ解析を行うことにより、DIV4の神経細胞にては、3種類すべての静脈麻酔薬により有意な[Ca2 +]iの上昇が認められた。また、PPFでは有意な細胞生存率低下が認められた一方で、TPS並びにMDZでは認められなかった。DIV8でも、PPFによる[Ca2 +]i上昇並びに細胞生存率の低下が認められた一方で、TPS及びMDZでは、両者とも見られなかった。さらに、DIV13では、3種類の麻酔薬は[Ca2 +]i上昇も細胞生存率の低下も引き起こさなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、ラット初代培養神経細胞を使用し、現在、本邦において臨床麻酔で頻用されている静脈麻酔薬３種類（チオペンタールナトリウム、ミダゾラム、プロポフォール）の幼弱神経細胞の各発達段階における質的な影響に関する評価を調べることに成功した。
トリパンブルーにより細胞の生死を判定する形態学的実験および、Fluo-4染色、アクアコスモスーaxiovert 200システム下にて神経細胞内カルシウム動態を測定するカルシウムイメージング法により蓄積された実験データの解析も順調に進行した。これらの実験系における結果を踏まえた上で、日本麻酔科学会、日本小児麻酔科学会、Society for Neuroscienceといった代表的な学会の場で発表を行い、内外の指導的立場の医師らと各発達段階の小児における静脈麻酔薬の使用方法に関する有意義な考察や検討を行い、高い評価を得た。そして、このような活発な意見交換を盛り込み、新規原著論文の初稿が完成した。英文校正も終了し、現在、同論文を海外有力雑誌に投稿し、初回の論文内容の査読は完了し、追加実験に関してジャーナルエディターとディスカッションを行っている状況である。
一方で、研究代表者の澁田の所属研究施設の変更に伴い、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）及びその関連シグナルの阻害薬であるJNK阻害薬、MEK1/2阻害薬、PDK-1阻害薬、フォスフォリパーゼC阻害薬を投与し、細胞生存率に対する影響を調べる研究に関するデータの安定的な取得が進まなかった点やPC１２細胞を使用した遺伝子導入条件の実験が当初の予定に比べて若干滞った点などを考慮したうえで、「2.おおむね順調に進展している。」との判断を下した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究に関しても、当初の通り進める予定である。以下に記述する。
代表的なセルラインであるPC12細胞を使用し、LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent (Life technologies )による、遺伝子導入条件の確認を引き続き行う。まず、PC12細胞に対するsiRNAの導入状況の確認として、GAPDH遺伝子に対するsiRNA（ポジティブコントロールのsiRNA）を導入し、GAPDH遺伝子（ポジティブコントロールsiRNAがターゲットとしている遺伝子）がノックダウンできているかを観察する。上記のポジティブコントロール確認後、siRNA （Silencer、 life technologies）によるNR-1, HIF-1α、p-53遺伝子の発現抑制モデルの導入条件の検討を順次行う。これらの検証はReal Time PCR法、及びウエスタンブロッティング法によって行う。
遺伝子導入方法としては、費用の面や使用するsiRNA量による細胞毒性の点などから試薬（LipofectamineTM RNAiMAX）による導入を第1選択としたい考えている。ただし、充分に標的遺伝子がノックダウンできない等、好ましい結果が得られない場合には、エレクトロポレーションによる遺伝子導入システム(Neon; Transfection System: life technologies)の使用を考慮している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
動物実験に使用する物品の購入が計画より少額であったため
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