| 研究課題/領域番号 |
15K10514
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| 研究機関 | 香川大学 |
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研究代表者 |
小野 純一郎 香川大学, 医学部, その他 (90363217)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 麻酔科学 / 揮発性麻酔薬 / 麻酔メカニズム / マイクロドメイン |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、揮発性麻酔薬の作用機序解明の研究である。これまでの報告では、細胞膜脂質あるいや個々の受容体タンパク質の機能解析が中心となっていたが、本研究は細胞膜脂質と受容体タンパク質を1つの機能コンプレックスとして捉える「脂質マイクロドメイン（以下マイクロドメイン）」という概念にスポットを当てたものである。マイクロドメインは構造的に高密度のコレステロール、スフィンゴ脂質、受容体タンパク質から成っている。マイクロドメインを蛍光プローブによって標識し、可視化することで揮発性麻酔薬がマイクロドメインに与える影響を捉えることを目的とする。この研究は麻酔状態下における脂質タンパク機能相関を解析するユニークな試みであり、麻酔メカニズム研究に新たな切り口を与えることが期待される。
平成27年度では、マイクロドメインおよび麻酔関連受容体タンパク質の標識設計を行う計画であった。 用いる標識はHalotag, SNAPtag, CLIPtagを予定していた。これらのタグ・タンパク質は、それ自体は発光せず、発光用低分子リガンドが結合して初めて発光するものである。特徴としてはGFPよりも発光時間が長く、発光のタイミングや強度を調節しやすい。複数種類のタグ・タンパク質を用いることで、1つの細胞を複数色で発光させることができる。これらのタグ・タンパク質をマイクロドメイン分画もしくは非マイクロドメイン分画に特異的に発現しているタンパク質に付加し、生細胞の細胞膜上に発現させることが本研究を遂行するうえで最も重要な点となる。標識タンパク質が発現すれば、共焦点蛍光顕微鏡を用いて生細胞膜上での挙動を特異的且つリアルタイムに補足することが可能となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マイクロドメインの標識には、そこに集積するGPI(glycosylphosphatidylinositol)アンカー型タンパク質を利用した。GPIアンカー型タンパク質はマイクロドメインの特異的マーカーとして知られている。また、マイクロドメイン分画と対を成す、非マイクロドメイン分画の標識にはトランスフェリン受容体タンパク質を用いた。Halotagを用いてGPIアンカー型タンパク質やトランスフェリン受容体を標識し、イソフルラン麻酔下の動態解析を行った結果は2015年日本麻酔下学会で報告を行った。麻酔関連受容体の標識については、GABAA受容体α1サブユニットにHalotagやSNAPtagを付加した標識遺伝子を作成した。これらの遺伝子をHEK293t細胞やラット胎児脳神経初代培養細胞にリポフェクション法により遺伝子導入を行ったが、発光が認められなかった。この原因として考えられるものに、標識遺伝子が細胞内に導入されていない、細胞内には取り込まれたが核内に移行できない、核内に移行できたが少量のため発現効率が極端に低いか、であると推測している。細胞密度、DNA量、リポソーム試薬量、反応時間等の実験条件を工夫して遺伝子導入を試みてみたが、現在のところGPIアンカーやトランスフェリン受容体タンパク質のような導入効率が得られていない。今後の方針として、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターの利用等を検討したいと考えている。また、GABAA受容体サブユニットだけでなく、NMDA受容体といった他の麻酔関連受容体から着手することも検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
当面の目標として、現在の遺伝子導入効率の問題をクリアしなくてはならない。リポフェクション法の条件を改善することで解決を図る計画だが、抜本的な解決のためにウイルスベクターを用いることも検討している。麻酔関連受容体を標識できるようになれば、1つの生細胞にマイクロドメイン標識遺伝子と麻酔関連受容体標識遺伝子の2種類を導入する。そして、揮発性麻酔薬作用下のマイクロドメインと麻酔関連受容体の動態の関連を検索する計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初は初代培養ラット胎児神経細胞を用いて遺伝子導入実験を行っていたが上手くいかず、問題解決のために遺伝子導入がしやすい株化細胞HEK293を用いて実験を行った。株化細胞は神経細胞に比べて培養コストがかからないため、実験費に残金が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
複数の遺伝子導入試薬を試したり、遺伝子設計を改めることで問題解決を図る計画のため、そこに資金を投入したい。
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