| 研究課題/領域番号 |
15K10526
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
藤田 義人 愛知医科大学, 医学部, 教授 (90238593)
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| 研究分担者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (70212462)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脳浮腫 / ノックダウン / アクアポリン / AQP4 |
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| 研究実績の概要 |
研究の基礎とるアクアポリン（AQP）Knockdownとover-expression細胞株の確立及び低酸素負荷、保護効果確認を重点に行った。
RNA interferenceによるknockdownが確認されている配列をもとに、shRNAを発現するvectorを作成したうえ、vectorに導入した。アストロサイトにtransfectionする方法として、Lipofectamine2000およびリポフェクション(Trans-IT Neural)を使用した。Transfection効率をリアルタイムPCR、およびウエスタンブロッテングにて確認した。おおかたAQP4の発現を２割程度に抑えていることを確認できた。一応の確立をみたと考えている。
AQP4のoverexpression細胞株の確率のため、hAQP4-M23およびhAQP4-M1を発現するラット星状膠細胞であるC6の作成を試みた。可視化のためVenusを挿入したpCAGIPuro-hAQP4-Venus vectorをM1 およびM23 それぞれ作成し,ラット星状膠細胞であるC6に、Lipofectamine2000を用いて、transfectionした。蛍光顕微鏡及び、ウエスタンブロッティングにて蛋白発現を確認した。また、hAPQ4-M23に関しては、permanent cell line を、蛍光顕微鏡の蛋白発現と、ウエスタンブロッティングでの蛋白発現の確認を終え、こちらも一応の確立をみたと考えている。
低酸素負荷を10％で行った。一定の安定性を持って細胞死を確認できる。細胞死がアポトーシスの割合等を検討している。低温の保護効果を検討している。温度と保護効果の安定性を見出したい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ノックダウンとover-expressionの確立し、低酸素の影響、低温の影響などの実験に進んでいる。これらの実験をさらにすすめていく必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、実際の低酸素における脳浮腫効果の解明を始めている。低酸素状態がアポトーシスを起こしている現況を定量的に評価できるよう、研究を進めている。それらを行った上で、ノックダウン、over-expressionをもちいてアポトーシスに対しての影響を検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度のアストロサイトの調達を現時点では、毎回ratをsacrificeしてのprimary cultureでではなく、業者からの購入した細胞を使用した。そのため、若干の経費の繰越となった。ただ、最終的には、primary cultureを行う予定である。また、低酸素、低温の実験の条件を調整しているため、これらの経費が繰り越されている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
計画に則り使用する予定である。早期に、低酸素、低温の条件の確立を目指す。これらの成果を学会等で発表する予定である。
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