| 研究課題/領域番号 |
15K10569
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
飛澤 悠葵 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70623768)
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| 研究分担者 |
畠山 真吾 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (10400136)
米山 徹 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50587649)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 糖鎖生物学 / 分岐型糖鎖 / 抗糖鎖モノクローナル抗体 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、研究計画どおりに抗体の樹立を目標に研究を行った。分岐型糖鎖はヒト、マウスにおいて構成要素はほとんど同一であり、抗原性も低いことが予想されるため、以下の二つの方法により抗体の作製を試みた。１）前立腺癌細胞を免疫したマウスの脾臓よりB細胞を取り出し、ミエローマと融合するハイブリドーマ法。２）前立腺癌細胞を免疫したマウスの脾臓より抗体遺伝子をクローニングし、ファージミドベクターに組み込むことでファージ上に抗体分子を発現させたファージ抗体ライブラリ法。
まずは１）の方法において、前立腺癌細胞DU145をマウスに免疫し作製したハイブリドーマにおいて、癌細胞に反応性を持つ抗体クローン96クローンを得た。各クローンのアイソタイプを決定し、さらに分岐型糖鎖構造をするGCNT2発現の低い細胞と高い細胞を用いてフローサイトメトリーにより反応性の異なる抗体の選別を行った。それぞれ得られた96クローンはすべてマウスIgGであった。高分岐型の糖鎖構造選択的に反応する抗体クローンは96クローン中には認められなかった。以上の結果から、高分岐型糖鎖構造認識抗体の獲得には免疫方法に改良を加える必要があると考えられた。
次に２）の方法においては、前立腺癌細胞PC3をAlumをアジュバントとして用い免疫を3回行った後、脾臓を摘出した。抗体のFv領域の遺伝子を獲得後、scFv抗体となるように抗体の重鎖と軽鎖をリンカーでつなげたのち、ファージ上に発現させた。本年度は109以上のバリエーションを有する抗体ファージライブラリを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、抗体の樹立を目的に研究を行いハイブリドーマ法により96クローンの抗体を獲得した。これらのクローンのうち、2クローンはO結合型糖鎖阻害剤処理により反応性が変化することがすでに分かっていたが、高分岐糖鎖構造特異的に反応する抗体は確認できなかった。一方で、ハイブリドーマ法でうまくいかない場合を想定し抗体取得の目的で抗体ファージライブラリを構築した。以上の事より、高分岐糖鎖に特異的な抗体の取得には免疫方法の検討など改善が必要であるが、おおむね順調に研究が進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に得られたクローンでは、高分岐型糖鎖を特異的にとらえる抗体が確認できなかったため、来年度は免疫手法を変えるなど手法を改善し、新たなクローンを樹立することも考えている。また、本年度は構築するだけにとどまってしまったが、抗体ファージライブラリもあるため、高分岐型糖鎖を捉える抗体をライブラリよりスクリーニングして探索する予定である。また、並行して行っていた分岐型糖鎖に対する基礎研究のデータよりGCNT2により形成される高分岐糖鎖構造の末端構造の一つが明らかとなってきたため、本構造の発現と癌悪性度との関連について検討を行う予定である。
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