| 研究課題/領域番号 |
15K10635
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
林 篤正 久留米大学, 医学部, 講師 (20341357)
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| 研究分担者 |
太田 啓介 久留米大学, 医学部, 准教授 (00258401)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 膀胱 / 間質細胞 / FIB/SEM / PDGFRα / SK3 |
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| 研究実績の概要 |
モルモットの排尿筋層間の間質細胞について、壁内神経と間質細胞とのコンタクトについて共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫組織化学法、またFIB/SEMを用いた三次元ストラクトーム解析を行った。
還流固定後に膀胱を摘出し平面状に包埋、膀胱のlayer面の方向で50μmの比較的厚い切片を作成し、whole mountでの免疫染色法（共焦点顕微鏡）を行った。現在排尿筋層内間質細胞については抗c-kit抗体、抗PDGFRα抗体、抗SK3抗体、抗vimentin抗体を用いて蛍光染色を行ったが、この細胞のphenotypeはPDGFRα(+)、SK3(+)、vimentin(+)、c-kit(-)であった。またこれらの細胞と神経各種マーカーとの接触状況を確認したが、遠心性自律神経との接近を示唆する所見が得られた。
FIB/SEMによる観察では、排尿筋層内に過去の透過電験法による細胞の特徴としてfibroblast 様の細胞が確認され、この細胞を三次元構築した。細胞形態は免疫染色法で得られたものと同じであった。壁内神経はこの細胞の表面上を走行していた。細胞の構造特徴は免疫染色もFIB/SEMによる三次元構築でも同様で扁平で、突起を形成していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
多数の細胞を一観察範囲に入れるために、細胞壁にコントラストを上げる至適倍率、固定方法を検討中である。現在60μm角の範囲で撮影しているが、この範囲で１－２個程度の細胞のみの観察で、全体像、また細胞同士の接着などを観察するには低倍率で観察する必要がある。
また免疫染色法によって標的細胞が標識されているが、免疫電顕法をFIB/SEMに応用したいと考えている。
しかし従来のTEMで行われてきた方法での標識では組織深層への標識物質（金コロイドやDAB）の浸透が得られないことが分かったので、この方法論を検討中である。
以上上記二点について時間を必要としている。
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| 今後の研究の推進方策 |
実際の画像取得は出来ているので、至適条件がわかれば再現性の高い方法論となりうる。
各種抗体を使用した免疫電顕法の応用を推し進める。この状況で正常動物での所見取得を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はもともと予算計上していたFIB/SEM使用に関するランニングコスト（ditectorの購入、調整、修理）への支出が次年度に繰り越すことになったため。
また本来予定していた免疫電顕法への実験経過が遅れ、同実験での試薬購入が次年度に繰り越しとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度の学会出張費（国際学会へ2演題予定）、論文投稿費用、FIB/SEMランニングコスト、免疫電顕法への試薬購入
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