| 研究課題/領域番号 |
15K10646
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
窪田 裕樹 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10347403)
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| 研究分担者 |
林 祐太郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40238134)
佐々木 昌一 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50225869)
岩月 正一郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70595397)
梅本 幸裕 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80381812)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 男性不妊 / PLC zeta / 遺伝子導入 |
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| 研究実績の概要 |
マウス精巣のcDNAライブラリーから既知のプライマーを用いて、PCR法によりPLCζ遺伝子(2.2Kb)の全長にわたり増幅させた。得られたPCR産物をゲル電気泳動により単離したのち精製したものを、TOPOベクターにサブクローニングした後にシーケンスを解析して全塩基配列がPLCζ遺伝子として正しいことを確認した。
このPLCζ遺伝子を制限酵素で切り出して、GFPまたはYFP遺伝子を含むベクターに融合蛋白を発現するようにサブクローニングした。PLCζ遺伝子+GFPまたはPLCζ遺伝子+YFPを制限酵素で切り出して、サイトメガロウィルスのエンハンサーとchickenのβ-actin プロモーターを含むpCAGベクターに組み込んで、融合蛋白の発現ベクターを作成した。また、コントロールとしてGFPまたはYFP遺伝子のみを発現するベクターも作成しておいた。
HEK293細胞に燐酸カルシウムを用いて前述の融合蛋白発現ベクターを遺伝子導入した。融合蛋白を正しく発現することを確かめるために、48時間の培養の後にHEK293細胞から淡白を抽出した、ウェスタンブロット法により合成された蛋白が、予想される分子量と一致することを確認した。
In vivoで融合蛋白発現ベクターの遺伝子導入を行うには、大量のベクターが必要であるため、上記で作成したベクターを、TOP10細胞をcompetent cellとして十分な量が得られるまで増幅しておいた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
正しく融合蛋白を発現するベクターの作成に時間がかかったため。
また、大量のベクターを作成する必要があり、ベクターの増幅にも時間がかかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
若干の遅れはあるが、概ね想定の範囲内で進行している。
予定通り、in vivoでの遺伝子導入を行い、transgenic spermを作成する。
効率良くtransgenic spermを作成するための条件設定については十分な検討が必要である。
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