| 研究課題/領域番号 |
15K10687
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
板倉 敦夫 順天堂大学, 医学部, 教授 (70262897)
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| 研究分担者 |
牧野 真太郎 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70570894)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | タンパク質メチル基転移酵素 / 遺伝子欠損マウス / 細胞特異的ノックアウト |
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| 研究実績の概要 |
L-アルギニンは細胞内でメチル基転移酵素スーパーファミリーに属するタンパク質メチル基転移酵素(protein arginine methyltransferases; PRMTs)によって、化学的に非常に安定なメチル化を受ける。PRMT1はL-アルギニンに2つ目のメチル基を転移する反応を触媒する分子である。PRMT1は遺伝子欠損によって胎生致死となるため、その機能を確認するには条件付ノックアウトマウスが必要である。本研究では血圧調節に関与するこのPRMT1のTrophoblast specific knockout miceを作製して、これを解析し妊娠高血圧症候群などの病態との関連を検討する。平成27年度は絨毛細胞特異的PRMT1遺伝子欠損マウスを完成させることを目標とした。Tpbpa（Trophoblast specific protein alpha）という、マウスの絨毛細胞に発現する遺伝子のプロモーター下流にCre遺伝子を連接した、絨毛細胞特異的Cre発現マウスをCMMR(Canadian Mouse Mutant Repository)より導入した。PRMT1アレルへのloxPノックインマウスと交配させ、絨毛細胞特異的PRMT1 遺伝子欠損マウスを得てた。さらに絨毛細胞特異的PRMT1遺伝子欠損マウスは胎生致死を示さずに誕生し、繁殖能力も有することを明らかとしている。
絨毛細胞におけるPRMT1発現の確認と組織学的検討：このノックアウトマウスを子宮内に保育している18.5日妊娠マウスより胎盤を採取し、細切後トリプシン処理を行い細胞を採取する。パーコール濃度勾配法および磁気細胞分離によって細胞を純化し絨毛細胞を得る。播種した細胞を形態的に絨毛細胞であることを確認し、RT-PCR法によってPRMT1の発現を検討した。
得られる胎盤が小さいため、現在のところ、RT-PCRによってホモ・ヘテロ欠損の絨毛細胞・胎盤を鑑別する技術が安定しておらず、容易な鑑別ができていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
この研究で克服すべき最大のポイントは、絨毛細胞特異的PRMT1遺伝子欠損マウスの作成であり、これが成功しているので、おおむね順調と考える。ただし、ノックアウトされた胎仔が外見のみで判別できないため、その都度ノックアウトマウスであることが判別できる方法の導入が必要であり、これの開発が新たに必要となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずは遺伝子欠損による胎盤の組織学的構造の変化を検討する。次にこのマウスが継代できることを確認し、繁殖可能であれば全胎仔の胎盤をノックアウトして、母獣の妊娠中の血圧等の変化を確認する。平成28年度はこの2点を完遂することを目標とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費が当初予定より安価となったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度の実験試薬の使用に充当する予定である。
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