研究課題/領域番号 |
15K10720
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研究機関 | 山口大学 |
研究代表者 |
佐藤 俊 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10534604)
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研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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キーワード | 子宮筋腫 / マスター遺伝子 / 異種移植 / DNAメチル化 |
研究実績の概要 |
本研究では,子宮平滑筋細胞において,エピジェネティクス変異により発現の変化したマスター遺伝子が下流の遺伝子の発現を変化させることで子宮筋腫が発生するという仮説のもとにマスター遺伝子(群)の特定を目指す。これまでにゲノムワイドなDNAメチル化解析,トランスクリプトーム解析および相互的ネットワーク解析による統合的解析により,3つのマスター遺伝子候補を抽出した。従来の培養系では,平滑筋細胞が筋腫細胞に変化してもそれを評価する方法がなく,遺伝子の機能解析が困難であったが,候補遺伝子の発現改変平滑筋細胞を用い,異種移植によりin vivoで筋腫を形成させることで,子宮筋腫の発生に関わる分子やその分子機構を特定する。さらにそれらの分子を標的とした薬物治療に発展させる。平成27年度は1. 候補遺伝子の発現改変細胞株の作成および2. 異種移植について検討した。 1. 候補遺伝子の発現改変細胞株の作成:当初3つのマスター遺伝子候補として,筋腫で高発現したNRG1と筋腫で低発現だったMAPK10およびNR3C1を選出していたが,使用した不死化平滑筋細胞株でMAPK10の発現が見られなかったため,新たにマスター遺伝子候補として筋腫で低発現のEPAS1を選出した。したがって,NRG1の過剰発現,NR3C1およびEPAS1をノックダウンした細胞株を作成した。 2. 発現改変細胞株をマウス腎被膜下に移植する異種移植系の検討:1.と並行して,不死化平滑筋細胞株の親株およびモック導入細胞株を用いて,ヌードマウスの腎被膜下への移植を試みた。移植後8週間で細胞塊を移植した腎臓を回収したが,移植細胞に由来する腫瘤は確認されず,この細胞株がヌードマウスで生着しないことが判明した。今後はSCID等の重度免疫不全マウスの使用を検討する。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度に到達目標の一つとしたマスター遺伝子候補の発現改変平滑筋細胞の作製については,候補遺伝子の一つが変更になったが,3つの候補遺伝子それぞれについての発現改変細胞株は作成できたので,目標はある程度達成できたと考えている。その一方で,候補遺伝子を複数個同時に改変した細胞株の作成も試みたが,まだ得られていないので,今後さらに作成を継続する。 発現改変細胞株をマウス腎被膜下に移植する異種移植系については,個体の価格の安さと飼育および手術時の扱いやすさからまず,ヌードマウスを選択し,検討した。細胞塊を移植した8週間後に移植腎臓を回収したが,回収した全ての腎臓で腫瘤は確認されなかった。さらに,GFPを発現するモック導入細胞株を移植した腎臓については,蛍光実体顕微鏡にて移植細胞に由来するGFP陽性細胞の有無も確認した。その結果,移植腎臓の約1/4でのみGFP陽性細胞が認められたが,その数は極めて少なかった。以上の結果から,この細胞株はヌードマウスには生着できないと考えられた。平成27年度中に異種移植系の確立はできなかったが,ヌードマウスが使えないことが確認され,さらに,SCID等の重度免疫不全マウスの使用を検討するという今後の方針は決めることができた。
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今後の研究の推進方策 |
平成28年度は以下の4項目について研究を進める。 1. マスター遺伝子候補を複数個同時に改変した細胞株の作成:3つの候補遺伝子NRG1,NR3C1およびEPAS1のうち,2遺伝子あるいは3遺伝子を同時に発現改変した細胞株を作成する。 2. 発現改変細胞株をマウス腎被膜下に移植する異種移植系の検討:モックを導入した不死化平滑筋細胞株を用いて,SCIDあるいは他の種類の重度免疫不全マウスの腎被膜下への移植を行い,移植細胞の生着および腫瘤形成を検証する。 3. 生体マウスの子宮に遺伝子発現を改変するウイルスベクターを直接感染させる導入系の検討:上記の異種移植系の確立がうまくいかなかった場合を考慮し,3つの候補遺伝子NRG1,NR3C1およびEPAS1の発現を改変するレンチウイルスベクターを生体マウス(近交系マウスC57BL/6)の子宮に直接感染させる導入系を検討する。この系においても複数の候補遺伝子の発現を同時に改変する方針で行う。 4. 特定したマスター遺伝子の作用機序の検証:特定したマスター遺伝子(群)の下流で発現変化する遺伝子群を明らかにすることで,子宮筋腫の発生の分子機構に関する知見を得るため,トランスクリプトーム解析を行う。特定したマスター遺伝子(群)の発現を改変した細胞株およびコントロールで網羅的に遺伝子発現の変化を解析し,遺伝子発現改変細胞株でコントロールと比較して有意に発現が変化する遺伝子群を抽出する。抽出した遺伝子群についてパスウェイおよびネットワーク解析を行い,特定したマスター遺伝子(群)の発現改変で影響を受けたパスウェイおよび遺伝子群を特定する。
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次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度に設備備品で購入予定であった蛍光実体顕微鏡ライカマイクロシテムズ・MZ10F I-T(150万円)を購入しなかったため,次年度使用額135万円が生じた。この蛍光実体顕微鏡に関しては次年度における購入を検討している。
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次年度使用額の使用計画 |
蛍光実体顕微鏡ライカマイクロシテムズ・MZ10F I-Tを購入する他,マウスの購入・飼育費,マイクロアレイ受注,ウイルスベクター関連試薬および成果発表の旅費等に使用する。
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