| 研究課題/領域番号 |
15K10774
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構（東京医療センター臨床研究センター） |
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研究代表者 |
難波 一徳 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員 (60425684)
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| 研究分担者 |
鈴木 喜大 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 研究員 (40712659)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | SLC26A4 / STASドメイン / 変異 / 発現系ベクター / 大腸菌 |
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| 研究実績の概要 |
ペンドレッド症候群の原因遺伝子の一つであるSLC26A4 の遺伝子変異は、先天性難聴の中で10%と高い発生率を占めている。特に人種を問わず高頻度に出現する病的変異p.H723R は、トランスポーターの内膜側の機能ドメインであるSTASドメイン上に存在し、SLC26A4 変異を原因とする患者の約50%の頻度占めている。本研究では、このp.H723R 変異が見られるSTASドメインのX 線結晶解析を行い、このp.H723R 変異による構造障害メカニズムを明らかにすることを目的とし、将来的に高頻度のペンドレッド症候群の患者に有効な分子治療薬の開発に結びつけるものとする。
そこで平成26年度では、このSTASドメインの結晶化を最初の目的とし、大腸菌大量発現系ベクターpET15bにSTASドメイン(535-729.aa)のシーケンスを挿入することによる発現系(STAS/pET15b)の構築を行った。また、STASドメインには不安定なループ領域(574-645.aa)が存在するため、結晶化を妨げる可能性を考慮しこれを除いた同STASドメイン領域の発現系(STAS-trunc /pET15b)の構築を行った。それぞれのベクターを大腸菌に形質転換し、目的蛋白質の発現量の確認を行った。
STAS/pET15bでは25℃と37℃の大腸菌の培養条件下で目的蛋白質の発現を行い、電気泳動による確認を行ったところ、可溶性分画に約90%程度の正常な発現を確認した。しかし、STAS-trunc/pET15bでは、発現蛋白質はほぼ100%が不溶性分画であった。そこでGST融合蛋白質による安定性を高めることを考慮しpGEX-6P-1ベクターに組み換え同発現確認を行ったところ、可溶性分画の発現に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
蛋白質の構造解析では良質の結晶を得ることが重要であり、そのためには発現効率の優れた発現系ベクターの構築を慎重に検討しておく必要がある。
この視点から本研究では、発現効率のよいベクターを着実に作成していると考えられる。当初の予定では、27年度中に大量精製、結晶化に繋がる発現系ベクターを完成させ、次のステップの大量精製、結晶化実験を開始することであったが、発現した蛋白質が不溶性の結果になったため、ベクターを再度組み換える必要が生じた。そのため本研究は、やや遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
作成した発現効率の良い発現系を用いてp.H723R変異ベクターの作成、および目的蛋白質の大量精製および結晶化を行う予定である。精製および結晶化条件の検討は、同ファミリー蛋白質のSLC26A5結晶構造の報告(Pasqualetto J. Mol. Biol. 2010, 400, 488-462)を参照することにより、効率よく研究を進めることができると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の予定では、前年度中に大量発現系を完成し、共同実験施設であるつくばの高エネルギー加速器研究機構へ出張し実験を行うための試薬類を購入する予定であった。しかし、記述にあるよう作成された大量発現系(STAS-trunc/pET15b)では、正常に発現することができなかったため、別の大量発現系ベクター(STAS-trunc /pGEX-6P-1)を構築する必要があった。この理由により実験が追加され、出張先で予定していた実験を先送りする必要が生じたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
p.H723R変異も含め、正常にかつ効率よく目的蛋白質を発現するベクターを完成させ、前年度の当初の予定に従い高エネルギー加速器研究機構に出張し、大量培養および精製の検討を開始する。その際、出張費、宿泊費、実験試薬類の購入のために次年度使用額が充てられる予定である。
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