| 研究課題/領域番号 |
15K10774
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
難波 一徳 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員 (60425684)
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| 研究分担者 |
鈴木 喜大 茨城工業高等専門学校, 国際創造工学科, 特命准教授 (40712659)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | SLC26A4 / ペンドレッド症候群 / ペンドリン / STAS / 大腸菌 / 大量発現系 / 発現ベクター |
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| 研究実績の概要 |
ペンドレッド症候群は、高度両側性感音性難聴および甲状腺水腫を伴う常染色体劣勢遺伝形式を取る遺伝性疾患であり、その原因遺伝子は主に陰イオントランスポーターであるペンドリンをコードするSLC26A4である。その変異は、先天性難聴の10%を占め、特に高頻度変異であるp.H723Rは、SLC26A4変異を原因とする患者の約50%の頻度占める。本研究では、このp.H723R変異が見られるペンドリンの機能領域であるSTASドメインのX線結晶解析を行い、このp.H723R変異による構造障害メカニズムの解析を目的とした。
結晶化には1mg単位の大量の精製蛋白質が必要であるため、SLC26A4のSTASドメイン領域の遺伝子配列を大腸菌大量発現系ベクターに導入し、大腸菌大量発現系の構築を行った。その中で蛍光蛋白質EGFPがSTASドメインのN末端に修飾されたpET28aベクターによる発現を試みたが、発現量が少ないことに加え、STASドメイン領域の顕著な変性が確認された。また、本大腸発現系では大腸菌の発育が悪いため、細胞毒性の可能性を考慮し、コムギ胚芽無細胞発現を試みたが、発現を確認できなかった。さらにN 末端にSUMO-Tagを修飾した発現およびT4リゾチームとの融合タイプの発現を試みたが十分な量の発現蛋白質を得ることができなかった。
本STASドメインの結晶構造解析はペンドレッド症候群の分子病態を知る重要な研究であるが、世界でまだ成功していない。本研究では主に大腸菌による大量発現系を用いてSLC26A4のSTASドメインの発現実験を一通り試たが、その方法では好ましくないという結論に至った。今後は、培養細胞系などを用いた発現系で発現を試み、結晶構造解析を進めるのが現実的と結論した。
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