研究課題
RNA干渉は二本鎖RNAと相補的な塩基配列をもつmRNAが分解される現象で、1998年Andrew Z. FireとCraig C. Melloにより発見された。 RNA干渉はsiRNA（small interfering RNA）という21-23bp塩基対の短い合成二本鎖RNAによって惹起されるが、siRNAを応用することに より特定の遺伝子を抑制することが可能となる。 申請者はCD40 siRNAを導入すると同時に抗原を感作した樹状細胞（CD40ノックダウン抗原特異的樹状細胞）をマウスに投与することに より、アレルギー反応が抑制されることを証明した。また、その作用メカニズムを調べた所、In vivo（生体内）にて誘導された抗原 特異的制御性T細胞を介して、CD40ノックダウン抗原特異的樹状細胞がアレルギー反応やアレルギー症状を制御していることを確認し た。 siRNA導入樹状細胞を投与する治療法は有用な治療手段であるが、siRNAを体内に投与することで予期せぬ副作用を引き起こす危険性を 含んでいる。そこで、siRNAを用いたIn vitro（生体外）における制御性T細胞の誘導や、その制御性T細胞を用いた治療法樹立が必要 とされている。 以上より、siRNAによる制御性T細胞の樹立についての研究を行ってきた。そして、H27年度はCD40 siRNA導入抗原特異的樹状細胞とTNF -alfa siRNA導入抗原特異的樹状細胞の樹立に成功した。また、H28年度ではCD40 siRNA導入抗原特異的樹状細胞とTNF-alfa siRNA導 入抗原特異的樹状細胞によるIn vitroにおける抗原特異的制御性T細胞の誘導に成功した。さらに、H29年度ではCD40 siRNA導入抗原特異的樹状細胞により誘導された抗原特異的T細胞をアレルギー感作前のマウスに投与することにより、血液中の抗原特異的IgEが抑制されることを証明した。
3: やや遅れている
CD40 siRNAを導入すると同時に卵白アルブミン（Ovalbumin、OVA）抗原を感作した抗原特異的修飾樹状細胞とT細胞を反応 させることによりIn vitroにおいてCD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞が誘導された。 またこれらの誘導されたCD4+CD25+制御性T細胞を単離し、OVA抗原特異的T細胞反応に添加するとOVA抗原特異的T細胞T細胞反応は有意に抑制された。一方、誘導されたCD4+CD25+制御性T細胞はOVA抗原以外の抗原における抗原特異的T細胞反応を抑制しなかった。そして、In vitroにて誘導された抗原特異的制御性T細胞を用いてIn vivo実験に移行した。まずIn vitroにて誘導された抗原特異的制御性T細胞をマウスに投与した。また抗原特異的制御性T細胞投与の際に、投与しない群を作製し、抗原特異的制御性T細胞の効果を比較検討した。抗原特異的制御性T細胞投与後、マウスにOVA抗原とアジュバントを投与してマウスへのOVA抗原感作を行った。さらに、OVA抗原を点鼻投与してアレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。作製後に血清を採取してELISAによる血清中OVA抗原特異的IgE測定を施行した。その結果、抗原特異的制御性T細胞投与群で非投与群と比較して血清中OVA抗原特異的IgEが有意に低下していた。また、一番最後の点鼻後のくしゃみ回数と鼻掻き回数を測定したが、非投与群と比較して抗原特異的制御性T細胞投与群では有意にくしゃみ回数や鼻掻き回数が低下していた。さらに、鼻粘膜を染色し鼻粘膜における好酸球浸潤数を調べた。鼻粘膜好酸球浸潤数は抗原特異的制御性T細胞非投与群と比較して投与群にて有意に低下していた。以上のように研究はすすんでいるが、しかし培養していた細胞に何等かの問題が生じ、不健康な状態や細胞死が認められた。以上より研究をやり直す必要が生じ、研究遂行に想定以上の時間が必要となっている。
現在行っている抗原特異的制御性T細胞のIn vivo効果研究をすすめる。まず血清中のOVA抗原特異的IgG1、OVA抗原特異的IgG2a、OVA抗原特異的IgG2を測定する。また、脾臓より リンパ球を採取し、分泌されるサイトカイン（IL-4、IL-5、IL-13、IFN-gmma）をELISAで測定する。脾臓T 細胞増殖を、[3H]thymid ineの取り込みによって評価する。これらの結果を特異的制御性T細胞投与群と非投与群の間で比較検討する。
本研究においては樹状細胞とT細胞の培養が必要となる。しかし昨年度の研究において培養していた細胞に何等かの問題が生じ、不健康な状態や細胞死が認められた。以上より次年度に研究をやり直す必要が生じた。次年度には、抗原特異的制御性T細胞のIn vivo効果研究を再検討する予定である。まず血清中のOVA抗原特異的IgG1、OVA抗原特異的IgG2a、OVA抗原特異的IgG2を測定する。また、脾臓より リンパ球を採取し、分泌されるサイトカイン（IL-4、IL-5、IL-13、IFN-gmma）をELISAで測定する。そして、これらの結果を特異的制御性T細胞投与群と非投与群の間で比較検討する。従って、次年度の研究に必要な試薬等の消耗品を購入する費用が必要である。
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