2018 年度実施状況報告書

ムチン16の常在細菌と点眼防腐剤に対する眼表面炎症制御での役割の解明

研究課題

研究課題/領域番号	15K10877
研究機関	和歌山県立医科大学
研究代表者	白井久美和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (70326370)
研究分担者	雑賀司珠也和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (40254544) 岡田由香和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (50264891)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2020-03-31
キーワード	Muc16 / 眼表面炎症
研究実績の概要	Muc16-KOマウスと野生型マウスにToll-like receptor(TLR)が認識する菌体成分を点眼し眼表面炎症反応の状態を検討した。Muc16-KOマウスと野生型マウスにLPS(Lipopolysaccharide)(1000 ng/ml、5 μl)またはPGN(peptideglycan)(1000 ng/ml、5 μl)を１日２回点眼投与し、１週間後にと殺、眼球摘出した。 (a)または(b)を行った。 (a)摘出眼球を４％パラフォルムアルデヒド固定、パラフィン包埋してパラフィン連続切片を作成した。IL-6、NF-κB リン酸化RelA、リン酸化Stat3の免疫組織学的局在をMuc16-KOマウスと野生型マウスの両群で比較、検討した。LPS点眼では、Muc16-KOマウスと野生型マウスの両群で、結膜、角膜においてIL-6、NF-κB リン酸化RelA、リン酸化Stat3の染色性をわずかに認めた。PGN点眼でもMuc16-KOマウスと野生型マウスの両群で、結膜、角膜においてIL-6、NF-κB リン酸化RelA、リン酸化Stat3の染色性をわずかに認めた。 (b)摘出眼球から結膜組織、角膜組織を摘出してmRNAを抽出し、IL-6、TNFαの発現をTaqMan Real-time RT-PCRで測定し、Muc16-KOマウスと野生型マウスの両群で比較、検討した。LPS点眼では、Muc16-KOマウスにおいて、IL-6、TNFαの発現は野生型マウスと比較してやや発現量が多かったが、有意差はみられなかった。PGN点眼では、Muc16-KOマウスと野生型マウスの両群で、IL-6、TNFαの発現に差はなかった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 Muc16ノックアウトマウスの繁殖状況より使用可能な匹数が限定される。
今後の研究の推進方策	Muc16ノックダウンヒト角膜上皮細胞にTLRが認識する菌体成分を暴露した時の炎症性反応の状態を検討する。 siRNAによりMuc16発現を抑制したSV40不死化培養ヒト角膜上皮細胞(Araki-Sasaki ヒト角膜上皮株)または培養初代ヒト角膜上皮細胞（コスモバイオ社取り扱い商品、ScienCell Research Laboratory社製）を用いる。申請者の研究室で確立している方法を用いてMuc16 siRNAノックダウン(Santa Cruz社)を行う。ノックダウン効率はSigmaキットによるRNA抽出後のTaqMan real-time RT-PCRとウエスタンブロットで確認する。菌体成分として緑膿菌からのLPS（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、1000 ng/ml）と黄色ぶどう球菌からのPGN(Fluka, Buchs, Switzerland、1000 ng/ml)を使用する。siRNA-Muc16ノックダウン角膜上皮培養細胞（株）とコントロールsiRNA細胞にLPSまたはPGNを24時間暴露する。24時間後にIL-6、TNFαの発現をTaqMan Real-time RT-PCRで, 48時間後にELISAで測定し両群で比較する。LPSまたはPGN暴露後、30分から6時間まで経時的に炎症性シグナル伝達(NF-κB リン酸化RelAとリン酸化Stat3)の活性化をウエスタンブロットで検討する。