| 研究課題/領域番号 |
15K10883
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| 研究機関 | 中部大学 |
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研究代表者 |
西沢 祐治 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (80252229)
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| 研究分担者 |
竹内 環 中部大学, 全学共通教育部, 助教 (90392018)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 網膜色素変性症 / ラパマイシン / アポトーシス / 小胞体ストレス / オートファジー / ロドプシン / エボジアミン |
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| 研究実績の概要 |
本研究では変異ロドプシン発現トランスジェニック動物（TgラットおよびTgウサギ）を利用し、Tg動物の網膜色素変性症発症過程で生ずるアポトーシスによる視細胞死がラパマイシン投与によって抑制される仕組みを解明する。最終的には我々のモデル動物における視細胞の長期機能維持を達成することによって、可能な限り侵襲の少ない網膜色素変性症治療法の確立を目的とする。
初年度（平成27年度）では、P347L型変異ロドプシン発現トランスジェニックラット（P347Lラット）網膜にラパマイシンを作用させると、生後14日目までにアポトーシスによって死滅する外顆粒層の減少をある程度抑えることができた。P347Lラット網膜の視細胞では変異ロドプシンが外節に輸送されずに細胞質内に蓄積する。これは正常ラット網膜の視細胞には見られない現症であり、P347Lラット網膜視細胞のアポトーシスが小胞体ストレスによることを強く示唆している。そこで平成28年度では、このアポトーシスに関与するタンパク質群の発現変化を免疫組織化学によって解析した。
小胞体ストレスにより誘導されるアポトーシス関連タンパク質の一つであるCHOPに対する抗体を使って免疫組織化学を行ったところ、ラパマイシンを投与したP347Lラット網膜の外顆粒層におけるCHOPの陽性反応が減少した。このことからP347Lラット視細胞のアポトーシス誘発経路にCHOPが関与していることが示唆された。
正常ラット網膜のin vitroスライス培養系および培養細胞で変異ロドプシンの発現様式を解析するための変異ロドプシン発現ベクターの構築を完了した。
P347L変異ロドプシン特異的モノクローナル抗体の作製は、陽性抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングが完了し、高濃度の抗体溶液作製に向けて腹水化を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の研究計画では、初年度にTgラット網膜の組織培養系を用いて、小胞体ストレス関連試薬を作用させ、P347Lラット網膜視細胞の細胞死抑止の仕組みを解析する予定であった。網膜の組織培養には新生仔ラットが不可欠のため、計画的な繁殖が必要であったが、P347Lラットの雌が原因不明の不妊を示し、さらに自家繁殖を行っていた正常ラットの雌が新生仔ラットの喰殺を頻発したために実験に必要な新生仔ラットを十分数確保できなかった。現在信頼できる業者から正常ラットの雌を購入してTgラットコロニーの回復を行うとともに、P347Lラットの雌の不妊の原因究明を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
Tgラットコロニーの回復は順調に進んでいるので、当初の研究計画の遅れを取り戻すべく、網膜のin vitroスライス培養系を確立し、小胞体ストレス関連試薬の効果を検証、視細胞死抑制の仕組みを解析する。スライス培養に必要な新生仔ラットの供給が十分でない場合に備えて、培養細胞系における変異ロドプシンの強制発現系を構築し、変異ロドプシン発現細胞におけるアポトーシス誘導とその抑制について解析を行う。必要な変異ロドプシン発現ベクターの構築はすでに完了している。Tgラット網膜のin vitroスライス培養系と変異ロドプシン発現細胞を用いた小胞体ストレス関連試薬の検索で効果の認められた試薬について、Tgウサギを用いて発展的な解析を行う。
P347L変異ロドプシン特異的モノクローナル抗体の作製は、現在陽性抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングが完了したので、実験に用いる高濃度抗体作製のための腹水化を行っている。得られた高濃度抗体をP347L新生仔ラットの眼球に投与して、変異ロドプシンを含む細胞のアポトーシス小胞の除去を行い、Tgラット網膜の錐体視細胞の機能維持の可能性を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Tgラットの繁殖計画に障害が出たために、実験に必要な新生仔ラットの供給が十分でなく、研究計画全体に遅れを生じた。スライス培養系の確立をペンディングしたため、設備備品で購入を計画していたマイクロスライサーの購入は見合わせた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Tgラットコロニーの回復のために大学設備の繁殖スペースを拡大する。そのための実験動物飼育費用の予算を拡充する。また、Tgラット網膜のin vitroスライス培養系の確立を進めるとともに、培養細胞における変異ロドプシンの強制発現系の構築を行う。そのための細胞培養消耗品の予算を拡充する。
その他は当初の研究計画通り使用する。
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