| 研究課題/領域番号 |
15K10890
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
菊池 孝信 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (50177797)
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| 研究分担者 |
太田 浩一 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70262730)
宮原 照良 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 講師 (80362135)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 自己免疫網膜症 / がん関連網膜症 / プロテオーム分析法 |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画の目的は、自己免疫網膜症患者血清が認識する網膜特異抗原タンパク質をプロテオーム解析法により網羅的に同定し、その発症機構を分子レベルで解明することにある。また、本研究で同定された抗原蛋白および既知の自己免疫網膜症に関する自己抗原蛋白を用いたプロテインチップ等を作製し、患者血清の網膜特異抗原を同定するとともにその抗体価を定量的に分析する系を構築し、自己免疫網膜症の新しい診断法を確立しようとする研究計画である。
ヒト抗原遺伝子のcDNAクローニングと大腸菌発現組換えタンパク質による抗原タンパクの同定を行った。プロテオーム解析により推定された抗原タンパク質について、ヒト網膜由来のRNAから調整されたMarathon-Ready cDNA（クロンテック社）を用いて抗原タンパクの全翻訳領域を含むcDNA断片をPCR法により増幅し、大腸菌発現ベクターに挿入し、ヒト由来の網膜特異抗原タンパクを大腸菌に産生させた。この組換えタンパクをHis-Tagアフィニティカラムを用いて精製し、ウエスタンブロットの試料とした。現在までに、既知の抗原タンパクを含め１０個の抗原タンパク質をクローニングした。８１例の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。複数の患者血清が認識する５種類の抗原蛋白（既知の抗原を含め）を見出した。その中で７例の患者血清が認識する抗原蛋白について、欠損変異組換え蛋白を作製し、エピトープ検索を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１０個の網膜抗原タンパクをクローニングすることが出来、その内の２種類の抗原タンパクについてエピトープ解析を開始しており、ほぼ順調に研究を進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに８０例以上の患者血清についてウエスタンブロット法、免疫染色法およびOCTによる検討を行って来た。そのなかで、錐体細胞、色素上皮細胞、ミューラー細胞特異的抗原を認識する血清を見いだしている。このような抗原タンパク質の同定は未だ成されていない。プロテオーム解析により特異的な抗原タンパク質の同定を進める。また、新たに同定された抗原タンパクについて、エピトープの探索・同定およびそのエピト―プを含む合成ペプチドを用いたELISA法の確立等を行い、抗体価と病態の進行度との比較検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エピトープの検索により、予想より複数のエピトープの存在が示唆され、合成ペプチドの作製費用が次年度多くなることが予想されたため、次年度に繰り越すこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２８年度請求額と合わせて、主に以下のような消耗品（試薬等）に使用する。
エピトープの部位決定に必要な合成ペプチドの作製費用として５０万円を予定している。
平成２７年度と同様に、抗原タンパクの同定のために必要なシークエンスグレイドの蛋白分解酵素やLC-MS用高純度試薬およびキャピラリー分析カラム等の経費として４０万円を予定している。
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