網膜移植における視細胞シートの最適化の試み

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K10913
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 万代 道子 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 副プロジェクトリーダー (80263086)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: iPS細胞 / 視細胞移植 / 網膜変性 / 生着 / シナプスマーカー

研究実績の概要

末期網膜変性モデルにおける視細胞移植治療の基礎研究として、よりよい機能回復が期待できる移植片の作成を目的とする。臨床応用に直接反映できるような移植片の準備を目標として検討を行った。
研究計画どおりの２種類の改変株を作成、自己組織化培養法似より網膜組織へと分化し、遺伝子や免疫染色によるマーカー蛋白の発現より、その表現系を確認、目的に沿った改変株が出来ていることを確認した。また、移植後のシナプスが観察・評価しやすいよう、移植片の視細胞側の前シナプスマーカー蛋白を蛍光標識し、実際に野生株移植片を用いて移植後グラフト側のシナプス末端が確認されることを確認した。その後、これらのシナプスマーカー株においても上記の改変を行った株を用意した。
ホスト側のシナプス末端も標識も試み、mGlR6 エンハンサー領域を用いて一過性遺伝子導入にて２次ニューロンである双極細胞特異的な蛍光発現を確認後、該当のマウスを作成、弱いながらも双極細胞特異的蛍光標識を確認した。、同じプロモーターを用いて後シナプス蛋白の標識を試みたもののマウスで十分な発現が得られず、現在交配によりネオマイシン耐性遺伝子を削除する試みを行っている。同時にバックアップとして双極細胞が十分に標識されたホスト網膜変性マウスをえるためにL７－gfpマウスとrd1マウスをかけあわせて、系統樹立を行った。これら双極細胞がラベルされたホスト網膜変性マウスに移植細胞のシナプス末端標識された移植片を移植、シナプス形成を示唆する所見を確認した。現在本研究の中心となる改変株での移植を行いその生着について評価を進めている。
またこれらの移植後の評価を進めるにあたって、多電極アレイ解析において基礎データーを収集し、解析方法について検討した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

予定どおりの細胞株を作成した。ホストマウスの方は予定どおりのものはできていないが、代わりのバックアップ系統を用意することにより、特に遅延なく実験を進めているが、当初の予定マウスが作成できればシナプス評価がより定量的に行えるため、引き続き作成も次年度に引き継ぐ予定である。

今後の研究の推進方策

予定どおりの改変株が作成できたので、今後用意したホストマウスでの移植を行い、生着、シナプスの形成を免疫組織学的に評価、従来の株と比較する。また、これまでに同時に準備を進めてきたシャトルアボイダンス試験による行動解析、多電極アレイ、ホスト網膜のカルシウムイメージングを用いた移植後網膜の光応答性などによる評価も合わせて行い、改変株移植後の視機能についても評価をすすめていく。
ただ、マウスの移植においてはどうしても手技的なばらつきが結果に影響をもたらすので、機能を見る上では定性的な評価も基準にできるよう、多電極アレイの解析方法についてもさらに詳細な検討をしていく。
ホストマウスについては代替的なマウスを用意して計画を進めているが、今後の検討のためにホストシナプス末端標識マウスの作成は次年度に持ち越して引き続き行う。そのため予算の一部を次年度に回した。

次年度使用額が生じた理由

シナプス形成を定量的に評価するシステムとしてマウスの作成を試みていたが、思った表現系が得られなかったため、バックアップ手段をとって実験を進めているが、今後の進展を考えて、次年度に引き継いでマウス作成を継続したいため、今年度の費用を次年度に持ち越したい。

次年度使用額の使用計画

引き続きシナプス末端標識マウス網膜変性モデルの作成費用に充当する。