| 研究課題/領域番号 |
15K10914
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構（東京医療センター臨床研究センター） |
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研究代表者 |
須賀 晶子 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 研究員 (70450400)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 網膜 / グリア細胞 / アデノ随伴ウイルス |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、遺伝子導入によってミュラーグリア細胞の増殖と神経細胞への分化転換を促進することを目的としている。網膜が障害されるとミュラーグリア細胞が増殖し、網膜神経細胞へと分化転換することが報告されているが、この再生現象は生物種間で大きく異なり、魚類のように網膜全層の神経細胞を再生できるものから哺乳類のように細胞増殖と神経細胞への分化がほとんど見られないものまで様々である。また人では網膜変性疾患で自然に視力が回復しないことから再生能力は非常に低いと考えられている。
我々はこれまでの研究からミュラーグリア細胞の増殖と分化転換にかかわると予想される遺伝子を選び、初年度はミュラーグリア初代培養細胞および網膜組織で過剰発現させる実験を行った。
遺伝子導入には細胞と組織への感染性および網膜組織を傷つけずに導入できる点から改変型アデノ随伴ウイルスを用いた。導入遺伝子を含むプラスミドベクターを作成したのちアデノ随伴ウイルスにパッケージングし、培養細胞、網膜組織培養、さらに生体マウス網膜への感染の検討を行った。培養細胞には効率よく感染し、導入遺伝子タンパク質の発現を確認できた。しかし成体マウス由来の網膜組織培養および生体マウスでの導入効率が予想よりも低く、増殖能および細胞系譜の追跡が困難と考えられた。
そこで感染効率に影響する条件を検討した結果、実験に用いるマウスの週令が遺伝子導入効率に大きく影響していた。最終的に生後１０日目以内のマウスに対しては、改変型ウイルスベクターの使用により硝子体側からある程度広範囲に遺伝子を導入することができた。本研究ではこれまでの実験結果から６週令以上の成体網膜に対して実験を行う予定だったが、ウイルスベクターの特性により生後１０日以内の幼若マウスを用いることに変更した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
遺伝子導入に用いるアデノ随伴ウイルスの条件検討で予想以上に時間がかかったため、網膜組織に対して候補遺伝子を導入する実験に入れなかった。入手しやすい幼若マウスに切り替えること、成体への遺伝子導入など高感染力のウイルスベクターが必要な場合は購入することで、この遅れは解消できると考えている。
また、幼若マウス網膜から採取した初代培養細胞を用いて導入遺伝子の条件検討を行っているが、採取できる細胞数と細胞の状態にばらつきあがり追試の数が多く必要となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞を用いた条件検討ではミュラーグリア細胞の細胞株を用いて検討および再現実験をより早く進められるようにする。ウイルスベクターの感染力は実験結果を大きく左右するため、網膜組織または生体網膜への遺伝子導入実験には、使用するマウスの週令を適切なものに限定するだけでなく受託生産により高品質のウイルスベクターを安定的に購入することにする。培養細胞で得られた結果をもとにミュラーグリア細胞の増殖性と分化転換にかかわると考えられる遺伝子を網膜組織に導入し細胞の変化を追跡する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
検討に使うミュラーグリア細胞の初代培養細胞は所属施設の飼育で生じた余剰マウスを主に用いたこと、成体マウスでの検討は、本年度はアデノ随伴ウイルスの感染条件検討実験が主になり予定よりも本実験で使う実験動物等の購入が少なかったことが次年度使用額が生じた理由である。生体マウス眼への感染実験ではより高感染力を持つウイルスの外部受託が必要となり、ウイルス作製にかかる費用が予定よりも大きくるため、その購入費として次年度に用いるのが適当と考えた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
株化されたミュラーグリア細胞の購入費および、感染力が非常に高いアデノ随伴ウイルス作製の外部受託費用として使用する。
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