| 研究課題/領域番号 |
15K10915
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本多 昌平 北海道大学, 大学病院, 助教 (90588089)
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| 研究分担者 |
北河 徳彦 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 医長 (00585135)
田中 祐吉 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 臨床研究所長 (50420691)
武冨 紹信 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70363364)
宮城 久之 北海道大学, 大学病院, 医員 (50596442)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 肝芽腫 / DNAメチル化 / 腫瘍内不均一性 / 分岐進化 / 予後予測マーカー |
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| 研究実績の概要 |
肝芽腫は胎児肝の発生過程におけるepigenetic異常、特にDNAメチル化異常が発癌および進展における主要なmodulatorとなっている。本研究では、同一患者から得られた正常肝、原発巣の各組織型、転移巣より個別に抽出した核酸(DNA・RNA)を用いて、肝芽腫のheterogeneity(腫瘍内不均一性)および転移へと進展する過程におけるDNAメチル化プロファイルおよびmRNA発現プロファイルをゲノムワイドに解析する。先行研究によって判明した肝芽腫における癌特異的なメチル化異常と照合し選別することによって、DNAメチル化異常に基づく腫瘍内不均一性と分岐進化の観点から、肝芽腫の新規分子生物学的マーカーを確立し、個別化治療を開発することを目的としている。
平成27年度の研究計画どおり、 肝芽腫7症例において、同一患者から採取された肝芽腫検体パラフィン包埋(FFPE)切片から、正常肝組織、原発巣、転移巣よりそれぞれmacrodissectionによって核酸(DNA,RNA)を分別回収し、メチル化ビーズアレイ解析(Infinium 450K)をおこなった。正常肝→原発巣→転移巣へと癌化・進展するにつれて、DNAメチル化プロファイルがどの様に変化するかを各患者間で解析中である。プレリミナリーなデータではあるが、有意にβ-value（＝メチル化率に同等）が変化したプローブを抽出してクラスター解析を行うと、正常肝から原発巣へと進化する過程においては高メチル化を示すCpGが圧倒的に多いことに対し、原発巣から転移巣へ進展する際にはグローバルに低メチル化傾向がみられることが示唆されている。今後統計解析手法による候補遺伝子の抽出を進め、既存のdatabase(ENCODE等)にて明らかにされているヒストンコード情報を照らし合わせることによって、より効率的に洩れなく選別する計画である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究計画どおり同一患者から正常肝組織、原発巣、転移巣よりそれぞれmacrodissectionによって核酸(DNA)を分別回収し、メチル化ビーズアレイ解析(Infinium 450K)をおこなった。解析サンプルは品質良好であり、解析結果は十分信頼のできるデータが得られた。網羅的解析であるため解析結果のデータ量はぼう大であり、現在統計解析手法を駆使して目下責任遺伝子の同定に向けて解析施行中である。当初計画していた発現アレイ解析はFFPE検体から解析に値する十分なmRNA採取が困難であることが判明した。現在microRNA解析(より塩基数が少ないため核酸抽出が可能である公算が高い)が可能であるかを検討中である。なお遺伝子発現に関しては、先行研究によって得られた脱メチル化細胞株の発現変化データや既知のENCODE情報などを用いることを計画している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度研究計画どおりに、肝芽腫細胞株のシスプラチン耐性株を作成し、発現アレイ解析をおこなってシスプラチン抵抗性に関わるDNAメチル化異常(先行研究及び上記in vitro解析の統合)を解析する。これまでに得られたビーズアレイ解析データ、および予後などの臨床病理学的因子と相関を認めるDNAメチル化異常(先行研究)を統合して、肝芽腫の発生・進展に関わるドライバーエピゲノム異常として働く遺伝子を絞り込む。更には、日本小児肝がん研究会(JPLT)より供与された多数例(約80検体)の肝芽腫腫瘍検体から得られたDNAを用いて、上記によって得られた遺伝子のDNAメチル化率をBisulfite pyrosequencing法にて測定する。
前段に記載したように、FFPE切片からのmicroRNA発現解析を進め、DNAメチル化異常とmicroRNA発現異常との関連性から、肝芽腫特異的なエピジェネティック変異を同定する試みを平行しておこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
mRNA発現アレイ解析が核酸の品質の問題から行うことができなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
miRNA発現解析をおこなう予定である。核酸抽出および解析にかかわる費用は概ね当初のmRNA発現アレイ解析と同等である。
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