| 研究課題/領域番号 |
15K10930
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
古屋 武史 日本大学, 医学部, 助手 (20568539)
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| 研究分担者 |
杉藤 公信 日本大学, 医学部, 助教 (10328750)
藤原 恭子 日本大学, 医学部, 助教 (40595708)
越永 從道 日本大学, 医学部, 教授 (70205376)
植草 省太 日本大学, 医学部, 専修医 (70746338)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 医学 / 臨床外科学 / 小児腫瘍学 / 横紋筋肉腫 / ピロール・イミダゾール・ポリアミド |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は、横紋筋肉腫特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1 の融合部位を認識するピロール・イミダゾール・ポリアミド（PIP）にアルキル化剤クロラムブシル(ChB)を付加したChB-PIP-1を合成し、この分子が標的配列特異的なDNA結合能と、細胞増殖抑制能を持つ事を確認したが、PAX3-FOXO1融合遺伝子陽性細胞のみならず、融合遺伝子を持たない陰性細胞に対しても増殖抑制能を示したことから、今年度はDNA認識領域を少しずらしたChB-PIP-2~4の3種類および、融合遺伝子を認識しないChB-Mismatch-PIPを合成しその機能解析を試みた。ペプチド合成機PMMS8を用いたPIP配列の合成、脱水縮重反応によるChBの付加、HPLCによる精製を経て完成した各PIPにつき、HPLC及び質量分析機を用いた解析により品質と純度の確認を行い、Gel Shift Assayにて標的配列特異的なDNA結合能を検討した。ChB-PIP-2~4のうち、ChB-PIP2および3はPAX3-FOXO1 の融合領域の配列に特異的に結合できること、ChB-PIP-4およびChB-Mismatch-PIPは標的DNA配列への結合能が無いことが判った。これらのPIPの抗腫瘍効果を検討するために培養細胞に対し各PIPを投与し、その生存率の変化をWST8アッセイにより調べたところ、ChB-PIP-1同様、ChB-PIP-2,4 およびChB-Mismatch-PIP はPAX3-FOXO1の有無にかかわらず、調べた全ての細胞の生存率を有意に低下させた。いずれのPIPも1μMでほぼ完全に細胞の増殖を抑制した。ChB-PIP-3には顕著な細胞増殖抑制能が見られなかった。いずれの細胞においてもG2/M フェーズにおける細胞周期の停止が生じることをフローサイトメトリーで確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度合成したChB-PIP4種類のうち3つは、昨年解析したChB-PIP-1同様、ChB単体と比較して顕著な細胞増殖抑制能を示したものの、その効果は横紋筋肉腫特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1陽性細胞のみならず、陰性細胞に対しても発揮された。既存の抗癌剤であるChBと比べて非常に強力であり、新規の抗腫瘍薬として期待できる薬剤ではあるが、当初の目的としていた融合遺伝子陽性細胞特異的な抗がん剤の開発は成功していないことから、若干遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2年間にわたり、PAX3-FOXO1融合遺伝子を標的とするChB-PIPの開発を試みてきたが、今年度合成したChB-PIPも前年度合成したChB-PIP-1同様、配列特異的DNA結合能を示すものの、PAX3-FOXO1融合遺伝子陽性細胞、陰性細胞の両方に対して増殖抑制効果を示し、PAX3-FOXO1を標的としたChB-PIPの開発は困難と考えた。そこで最終年度は、ChBと異なるアルキル化剤CBIを付加したPIPの合成と機能解析を試みる。また、融合遺伝子特異的ではないものの、ChB-PIP-1,2,4およびChB-Mismatch-PIPはChB単体と比較して強力な増殖抑制効果を持つことから、上記の解析と並行して、これらのPIPがどのような作用でG2/Mアレストによる細胞周期停止を促すのか詳細な分子メカニズムを検討していく。
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