| 研究課題/領域番号 |
15K10962
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
落合 博子 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 室長 (60374162)
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| 研究期間 (年度) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| キーワード | 皮膚創傷治癒 / 皮膚再生 / 間葉系幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
筆者は、これまで骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC: Bone marrow derived Mesenchymal Stem Cell)を皮膚の創傷に移植すると正常に近い皮膚構造が再生されることを確認し、すでに臨床応用の実績がある。多能性幹細胞MUSE細胞（Multilineage- differentiating stress enduring cell）はMSCの一部の細胞とされ、皮膚や脂肪から容易に採取でき、移植すると心筋や肝臓の損傷部位に高率に生着し機能的な細胞に分化することが知られている。損傷皮膚や軟部組織に対しても、創傷治癒促進効果が期待できる。
平成２７年度は、成獣F３４４オスラットの骨髄由来皮膚間葉系幹細胞(BMSC: Bone marrow derived Mesenchymal Stem Cell)と皮膚由来MUSE細胞の適切な培養方法を追随検討した。次年度のラット背部皮膚欠損創に移植した場合の創傷治癒の比較を行うための予備実験を行った。
平成２８年度は、過去にBMSCをブタに移植を行った結果を統合し、国際学会で口演発表するとともに、英文論文を投稿した。実験に関しては、培養されたBMSCとMUSE細胞を用いた実験を開始している。F３４４ラット背部に３×３cmの皮膚全層欠損創を作成し、周囲皮内、筋膜下へ細胞を注入移植した群と潰瘍に塗布した群を作成し、肉眼的経過を記録、組織学的な創傷治癒の差異を検討中である。創部の被覆方法と、細胞移植の量決定に難渋しており、現在いくつかの方法を検討中であるが、BMSCとMUSE細胞移植群間に明らかな差異を認めない。両者ともに、皮膚創傷治癒を早め、瘢痕形成抑制効果を認めるという結果を得ている。また、今後の実験のために、GFPマウス皮膚より線維芽細胞などの間葉系細胞を培養後、MUSE細胞を同定している。今後の免疫不全マウスの背部創に移植することで、より詳細な組織学的検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの研究成果を一部国際学会で発表し、英文誌への投稿を行うことができた。
研究は、適切な実験方法や評価方法をまだ検討中だが、進捗状況に特に問題はないと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
ラット皮膚欠損創に対する幹細胞投与方法を検討後、GFPマウス、免疫不全マウスを用いた実験に移行する。
1.GFPマウス皮膚由来MUSE細胞の培養
2.免疫不全マウスの皮膚創傷へのMUSE細胞移植および組織学的検討
皮膚潰瘍モデル：免疫不全マウスの背部にリングを装着した皮膚欠損創を作成。MUSE細胞を創部に局注・移植し、創治癒の過程を肉眼的に観察し、デジタルカメラで撮影し、潰瘍面積および肉芽形成の分析を行う。コントロールとして、線維芽細胞およびBMSCを用いる。採取した組織は凍結切片とし、蛍光顕微鏡により移植したGFP細胞の生着数と生着部位を確認する。移植細胞の機能評価は、組織学的検討を行い、膠原線維の配列や成熟の評価を行う。免疫染色によるαSMA, Cytokeratin、弾性線維などの発現を検討する。Western blottingなどによりTGFβ,HGFの発現量の検討を行う。
3.良好で迅速な皮膚創傷治癒を得るための条件を模索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ予定通りの使用額であり、問題ないと思われる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
免疫不全マウスの皮膚創傷へのMUSE細胞移植および組織学的検討：免疫不全マウスの背部にリングを装着した皮膚欠損創を作成し、皮膚潰瘍モデルとする。MUSE細胞をPBSに浮遊させ、創縁および潰瘍底に局注・移植し、創治癒の過程を肉眼的に観察し、デジタルカメラで撮影し、潰瘍面積および肉芽形成の分析を行う。コントロールとして、線維芽細胞およびBMSCを用いる。
また、MUSE細胞移植後1，3，5，7日目に創部を採取する。採取した組織は凍結切片とし、蛍光顕微鏡により移植したGFP細胞の生着数と生着部位を確認する。移植細胞の機能評価は、組織学的検討により行う。マッソントリクローム染色により、膠原線維の配列や成熟の評価を行う。免疫染色によるαSMA, Cytokeratin、弾性線維などの発現を検討する。Western blottingなどによりTGFβ,HGFの発現量の検討を行う。
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