酸化ストレス誘導蛋白質であるＷＤＲ35/ｎａｏｆｅｎ遺伝子の転写制御因子の同定

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K10998
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 馮 国剛 愛知医科大学, 医学部, 講師 (70351111)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 転写因子Egr-1 / 転写調節 / 酸化ストレス / アポトーシス

研究実績の概要

マウスの神経芽細胞腫 Neuro2A 細胞を用いて、酸化ストレスによるWDR35/naofen 発現増加の制御機構とそれによって誘導したアポトーシスについて検討した。Real-time PCRと western blot法を用いて、過酸化水素はEgr-1の活性化とWDR35/naofenの発現に対する影響を遺伝子レベルとタンパク質レベルで調べた。過酸化水素を投与した細胞において、投与後6時間からWDR35/naofenの発現が有意に増加し、12時間後に最大におなったと同時に、caspase-3の活性も増大した。同様に、過酸化水素は濃度依存的及び時間依存的にEgr-1の発現も増加させた。Wild-type Neuro2a細胞と比較して、Egr-1 overexpressionした細胞において過酸化水素はWDR35/naofen発現をさらに有意に増加させたと同時にアポトーシスも促進した。また、WDR35/naofen overexpressionした細胞において、アポトーシスが有意に増加したことに対して、siRNAによるWDR35/naofen発現のノックダウンは、過酸化水素による誘導したアポトーシスを明らかに抑制した。以上の結果から、Neuro2A 細胞において過酸化水素によって誘導した酸化ストレスは転写因子であるEgr-1を活性化し、WDR35/naofen発現を増加することを介してアポトーシスを促進する可能性が示唆された。酸化ストレスによる神経細胞障害にWDR35/naofenが関与するという新しい発生機序を見出し、酸化ストレスによる神経細胞障害の治療に際して、WDR35/naofenが新た分子標的となる可能性が考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々はマウスのマウス神経芽細胞腫 Neuro2A 細胞を用いて、転写因子Egr-1 がWD40 reapeatドメンを持つ蛋白質WDR35/naofenのプロモーター活性を制御することを研究してきた。Neuro2A 細胞において酸化ストレスは転写因子であるEgr-1を活性化させ、WDR35/naofen発現を増加することを介してアポトーシスを誘導するという新しい機序を見出した。
転写因子Egr-1によってWDR35/naofen発現を調節されることを確認するため、siRNA によるEgr-1の発現をノックダウンし、、WDR35/naofen発現に対する影響を調べていた。三社のメーカーからEgr-1に対するspecific siRNAを5セット購入し、ノックダウン実験を行ってきたが。すべてのsiRNAはEgr-1の遺伝子発現をノックダウンできななかった。原因はまた不明であるが、その中の1セットsiRNAが他の細胞においてEgr-1の遺伝子発現を効率よくノックダウンすることが報告されていたにもかかわらず、Neuro2a細胞においてEgr-1のノックダウンできなかった。これから、CRISPR-Cas9システムを用いて、Egr-1遺伝子のノックアウト細胞を樹立すると予定している。

今後の研究の推進方策

1. CRISPR-Cas9システムを用いて、Egr-1遺伝子のノックアウト実験
CRISPR-Cas9システムを用いてEgr-1を標的遺伝子としてノックアウトする細胞を樹立する。樹立したEgr-1遺伝子ノックアウト細胞において、WDR35/naofen発現の変化について解析する。さらに、細胞に過酸化水素の投与によって誘導した酸化ストレスはWDR35/naofenの発現に対する影響を調べると同時に、アポトーシスの発生についても検討する。また、上記の細胞にEgr-1 やWDR35/naofen遺伝子をそれぞれ単独あるいは同時に発現させ、アポトーシスの発生に対する影響を解析する。
2. 転写因子であるEgr-1によって制御するWDR35/naofen発現のシグナル伝達経路を解析する。
Wild-typeあるいはEgr-1遺伝子のノックアウトしたNeuro2a細胞や、WDR35/naofen overexpression あるいはsiRNAの導入をした細胞から、mRNAを抽出し、マイクロアレイを用いて、WDR35/naofenの上流と下流の物質を網羅的に検索する。酸化ストレスによるWDR35/naofenの発現増加とそれによって誘導したアポトーシス発生のシグナル伝達経路を解析する。特に、ブピバカインによる神経細胞アポトーシスにおいてAkt、AMPKとp38MAPKが関与すると報告されていたので、これらの分子との関連について精査する。

次年度使用額が生じた理由

今年度は、Neuro2a細胞にsiRNA導入によるEgr-1遺伝子発現がノックダウンできなかったため、次年度にCRISPR-Cas9システムを用いて、Egr-1遺伝子のノックアウト細胞を樹立する実験を予定している。

次年度使用額の使用計画

次年度は上記の研究計画を推進するため、細胞培養試薬、抗体及び分子生物実験試薬の購入に使用する。また、研究結果の発表を行うための国内学会参加費、旅費や論文の英文校閲の謝金等にあてる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Propofol reduces liver dysfunction caused by tumor necrosis factor-α production inKupffer cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Li J, Kandatsu N, Feng GG, Huang L, Kinoshita H, Okada S, Fujiwara Y
  • 雑誌名: J Anesth. 巻: 30 ページ: 420-426
  • DOI: 10.1007/s00540-016-2145-x.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Phosphatidylinositol 3-kinase inhibition induces vasodilator effect of sevoflurane via reduction of Rho kinase activity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto Y, Feng GG, Satomi S, Tanaka K, Fujiwara Y, Kinoshita H.
  • 雑誌名: Life Sci. 巻: 177 ページ: 20-26
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2017.04.005.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Branched-chain amino acids alleviate hepatic steatosis and liver injury in choline-deficient high-fat diet induced NASH mice. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takashi Honda, Masatoshi Ishigami, Fangqiong Luo, Ma Lingyun, Yoji. Ishizu, Teiji Kuzuya, Kazuhiko Hayashi, Isao Nakano, Tetsuya Ishikawa, Guo-Gang Feng, Yoshiaki Katano, Tomoya Kohama, Yasuyuki Kitaura, Yoshiharu Shimomura, Hidemi Goto, Yoshiki Hirooka.
  • 雑誌名: Metabolism Clinical And Experimental. 巻: 69 ページ: 177-187
  • DOI: 10.1016/j.metabol.2016.12.013.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sevoflurane inhalation accelerates the long-term memory consolidation via small GTPase overexpression in the hippocampus of mice in adlescence. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakamura E, Kinoshita H, Feng GG, Hayashi H, Satomoto M, Fujiwara Y.
  • 雑誌名: PloS One. 巻: 11 ページ: e0163151
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0163151.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] High oxygen modifies vasodilator effect of cysteine via enhanced oxidative stress and thromboxane production in the rat mesenteric artery. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yasuda Y, Feng GG, Li J, Nakamura E, Hayashi H, Sato M, Fujiwara Y, Kinoshita H.
  • 雑誌名: Pflugers Arch. 巻: 468 ページ: 1555-1564
  • DOI: 10.1007/s00424-016-1857-y.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intermittent local periodontal inflammation causes endothelial dysfunction of the systemic artery via increased levels of hydrogen peroxide concomitantly with overexpression of superoxide dismutase. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Y, Saito T, Feng GG, Li J, Yasuda Y, Kazaoka Y, Fujiwara Y, Kinoshita H.
  • 雑誌名: Int J Cardiol. 巻: 222 ページ: 901-907
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2016.08.099.
  • 査読あり
• [学会発表] SH-SY5Y細胞においてブピバカインはＴ型カルシウムチャネルを抑制し、アポトーシスを誘導する (2017)
  • 著者名/発表者名: 馮 国剛、 田中 久美子、藤原 祥裕、裕岡田 尚志郎
  • 学会等名: 第90回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 日本長崎
  • 年月日: 2017-03-15 – 2017-03-17