| 研究課題/領域番号 |
15K11003
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
笹野 泰之 東北大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (30196191)
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| 研究分担者 |
中村 恵 東北大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (20431512)
逸見 晶子 東北大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (40613055)
鈴木 治 東北大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (60374948)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 骨 / 象牙質 / 硬組織 / 石灰化 / タンパク / リン酸カルシウム / 質量顕微鏡 / ミネラル解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、石灰化前と石灰化後の骨と象牙質等の硬組織を研究対象とし、質量顕微鏡法を用いて基質タンパクを解析するとともに、エネルギー分散型X線分析、赤外分光法およびX線回折を用いて基質のリン酸カルシウム結晶の成長・成熟程度を調べ、石灰化に伴い分解される石灰化制御基質タンパクを解析することを目的とする。
平成２７年度では、質量顕微鏡のための試料作製方法について検討した。（１）生後３日齢Wistarラットを深麻酔で安楽死させ下顎骨を摘出し、次の方法で凍結包埋した。①未固定・非脱灰 ②4%パラホルムアルデヒド固定・非脱灰 ③4%パラホルムアルデヒド固定・10%EDTA脱灰 ④Methanol-Chloroform化学固定・非脱灰 ⑤Methanol-Chloroform化学固定・10%EDTA脱灰。（２）連続切片を作製し、導電性を持たせ酸化インジウムスズがコーティングしてあるスライドガラスに載せ、タンパクを質量顕微鏡を用いて検討する予備実験を開始した。
さらに、リン酸カルシウム結晶とタンパクの存在領域を同一組織切片上で解析する手段として、エネルギー分散型X線分析と共焦点レーザー顕微鏡解析の併用を検討する予備実験を下記のように開始した。（１）2週齢Wistarラットを麻酔下に心臓から4%パラホルムアルデヒドを灌流して固定し、下肢骨を摘出し、パラフィンに包埋して連続切片を作製した。（２）脱パラフィン後、切片をエネルギー分散型X線分析で検討し、ミネラルを構成するカルシウムとリンの元素が集積する領域を可視化した。さらに同一の切片に抗II型コラーゲン抗体を用い、FITCを二次抗体として、蛍光免疫染色を施し、共焦点レーザー顕微鏡を利用して、II型コラーゲンタンパクの存在領域を可視化した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究分担者 逸見晶子助教が産休・育児休暇のため、平成２７年度の期間で研究活動に参加できなかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２８年度では、エネルギー分散型X線分析と共焦点レーザー顕微鏡解析を併用して、ミネラルが集積する領域とII型コラーゲンタンパクの存在領域を総合的に検討して、ミネラルとII型コラーゲンタンパクの存在部位の関連について検討を進めたい。さらに、質量顕微鏡を利用し、骨と象牙質および石灰化軟骨において、基質のプロテオームを解析し、ミネラルと関連するタンパクの動態を検討する予定である。また、その際、石灰化組織をX線回折と赤外分光法で調べ、リン酸カルシウム結晶の成長・成熟についても解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究分担者 逸見晶子助教が産休・育児休暇のため、平成２７年度の期間で研究活動に参加できず、予定していたミネラル解析等の研究に遅れが生じたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２８年度の研究費の主な使用計画を以下に記載する。なお、平成２７年度の未使用額と平成２８年度請求額を合わせ、平成２８年度の研究遂行に使用する。
（実験用動物・ラット）平成28年度では、最少でも、生後２週齢30匹（60千円）と生後３日齢30腹（60千円）が必要である。（プラスチック・ガラス器具）質量顕微鏡用、ミネラル解析用、免疫電子顕微鏡用の試料作製で必要である。（固定剤、試料包埋剤等）化学固定剤、試料凍結用の包埋剤、電子顕微鏡用の包埋用樹脂等が必要となる（質量顕微鏡用スライドガラス）専用のスライドガラス（50千円／25枚）が最少で200枚（400千円）必要である。（国内旅費・外国旅費）研究打ち合わせ及び成果発表のための旅費として、約300千円を見込む。
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