| 研究課題/領域番号 |
15K11003
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
笹野 泰之 東北大学, 歯学研究科, 教授 (30196191)
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| 研究分担者 |
中村 恵 東北大学, 歯学研究科, 助教 (20431512)
逸見 晶子 東北大学, 歯学研究科, 大学院非常勤講師 (40613055)
鈴木 治 東北大学, 歯学研究科, 教授 (60374948)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 石灰化 / 歯胚 / 有機質 / 質量顕微鏡 / 基質 / 細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、骨や象牙質等の硬組織を研究対象とし、質量顕微鏡法を用いて解析するとともに、エネルギー分散型X線分析（SEM-EDX）を用いて基質のリン酸カルシウムの動態を調べることを目的とする。平成２９年度では、生後３日齢Wistar系ラットの上下顎を以下①②③の方法で凍結包埋試料とし、質量顕微鏡で検討した。①未固定・非脱灰・凍結包埋 ②4%パラホルムアルデヒド固定・非脱灰・凍結包埋 ③4%パラホルムアルデヒド固定・10%EDTA脱灰・凍結包埋。切片の組織学的観察および質量顕微鏡による予備的検討の結果、組織形態の保持、シグナルの検出状態等の観点から、②及び③が質量顕微鏡用に相応しい試料作製方法と判断され、歯胚を中心とした関心領域に、特定の質量電荷比にピークを示す分子が認められた。シグナルは歯胚における歯乳頭、エナメル上皮等に見られ、これらの分子はデータベース検索から特定の脂質と想定された。なお、質量顕微鏡から得られた歯胚における脂質の局在を異なるアプローチとして組織化学的に確認することを目的とし、ラット歯胚における脂質分子の分布をSudan Black B 染色で検討した。胎生１８日齢のラットの頭部を以下①②の方法で凍結包埋試料とした。①4%パラホルムアルデヒド固定・非脱灰・凍結包埋。②4%パラホルムアルデヒド固定・10%EDTA脱灰・凍結包埋。凍結切片を作製し、Sudan Black B 染色を施した。①および②とも、歯乳頭、エナメル上皮等に染色性が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
質量顕微鏡の検討結果の解析に想定以上の時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成３０年度では、平成２９年度の質量顕微鏡による検討で、歯胚の関心領域に特定の質量電荷比のピークを示した脂質分子を同定する予定である。また、さらに高解像の解析が期待できるタイプの質量顕微鏡を利用し、歯胚におけるどの細胞にシグナルが分布するかを特定したい。また、生後３日齢Wistar系ラットの上下顎の4%パラホルムアルデヒド固定・非脱灰・凍結包埋試料および4%パラホルムアルデヒド固定・10%EDTA脱灰・凍結包埋試料にSudan Black B 染色を施し、質量顕微鏡で認めた脂質と組織化学的手法で可視化できる脂質との関連について検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ラットを用いて、質量分析イメージング法（質量顕微鏡法）により基質タンパクのプロテオームを解析する計画であったが、タンパク質の解析のためには事前に検討を必要とする事項が多く、最初の段階の解析では、脂質分子を対象として取り組むことに変更した。この変更により、実験計画に遅れを生じた。また、研究分担者の逸見晶子助教が産休・育児休暇のため、平成２７年度の期間で研究活動に参加できなかったことも遅れの一因となった。
平成３０年度の研究費の主な使用計画を以下に記載する。
（実験用動物・ラット）生後３日齢10匹（20千円）が必要である。（プラスチック・ガラス器具）質量顕微鏡用、ミネラル解析用の試料作製に際して必要である。（固定剤、試料包埋剤等）化学固定剤、試料凍結用の包埋剤が必要となる（質量顕微鏡用スライドガラス）専用のスライドガラス（50千円／25枚）が100枚（200千円）必要である。（質量顕微鏡利用料金）40千円／日として年間10日間の利用を見込む。（人件費・謝金）資料整理のための人件費を10千円見込む。（国内旅費・外国旅費）研究打ち合わせ及び成果発表のための旅費として、300千円を見込む。
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