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骨芽細胞株MC3T3に対し遺伝子編集により、Dmp1発現を低下させた細胞を作製し、三次元細胞培養状態での骨芽細胞株の分化状態の変化および形態変化の検討を行った。
Dmp1発現低下細胞について検索する前に、細胞の分化に影響を及ぼすと考えられている培地中のリン酸濃度に関する検討を行った。二次元平面培養で、リン酸濃度を0mMから50mMの間で変化させ石灰化物形成能を検討した所、培養開始から5週間後の日数では、3mM以上のリン酸濃度において、アリザリン染色陽性所見を示す明らかな石灰化物形成が認められた。次に、三次元細胞培養条件下で、リン酸濃度を10mM濃度、50mM濃度としてMC3T3細胞の三次元細胞培養を行い、三次元細胞培養条件下でのリン酸濃度が細胞形態および細胞の分化能に与える影響を比較検討した。10mM濃度および50mM濃度のいずれにおいても骨芽細胞は三次元細胞培養条件下で生存が可能で、細胞の形態観察においてリン酸濃度の上昇に伴う明らかな細胞変性、細胞壊死の増加等の細胞障害の影響は観察されなかった。
リン酸濃度10mMと50mMで培養した三次元細胞培養条件下において、免疫組織化学染色により、転写因子および骨基質蛋白質の発現検索を行い、細胞の分化状態の検討を行った。10mM濃度と50mM濃度の細胞分化の状態を比較すると50mM濃度では分化の初期の指標と分化の進んだ指標となる蛋白質が混在して観察され、生体骨組織とはやや異なる状態が観察された。
リン酸濃度の影響の検討結果から、Dmp1発現低下細胞株の三次元細胞培養でのリン酸濃度を10mMとして、培養を行い、コントロールと比較すると一部のDmp1発現低下クローンで、細胞がコラーゲンゲル上に留まり、ゲル内へは浸潤していかないことが明らかとなった。このことからDmp1の有無が細胞分化に関係し力学的負荷に対応している可能性が推測された。
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