| 研究課題/領域番号 |
15K11010
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
樋山 伸二 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 助教 (60314754)
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| 研究分担者 |
吉子 裕二 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 教授 (20263709)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 破骨細胞 / 骨代謝 / エストロゲン / 骨髄骨 |
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| 研究実績の概要 |
骨代謝、特に破骨細胞の機能制御に関わるエストロゲンに特異的に応答する遺伝子を見出し、その調節機構を解明するため、エストロゲン（E2）を単回投与した雄ウズラの骨髄骨形成モデルを用いて、以下の実験を行なった。
1.ウズラ骨髄骨の破骨細胞におけるエストロゲン応答遺伝子の同定を行なうため、E2投与３日後の骨髄細胞を採取し、RANKL/M-CSFにより破骨細胞へ分化させた。培養期間中、培養中期、ならびに培養終了直前に17β-エストラジオール（17β-E）を添加した結果、17β-Eによりアクチンリングの形成不全あるいは崩壊、ならびに骨吸収に関連する酵素の分泌の減少などが認められた。これらの結果とDNAマイクロアレイ解析で得られた候補遺伝子と照らし合わせ、いくつかの遺伝子をエストロゲン応答遺伝子の候補とした。
2.破骨細胞の分化過程におけるエストロゲン応答遺伝子の候補遺伝子の発現をRT-PCRにより検討したところ、17β-Eにより発現量に大きな変動が見られないが、タンパク質の発現の減少が認められたもの、mRNAの発現が増減したものが確認された。さらに、それらの変動は17β-Eの添加時期によって異なっていた。
3.エストロゲン応答遺伝子と考えれる遺伝子が見出されたことから、哺乳動物の破骨細胞におけるこれらの遺伝子の解析を速やかに行なうため、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞の培養に着手した。
以上の結果から、骨髄骨の破骨細胞において、エストロゲン応答遺伝子の候補がいくつか見出された。これらの遺伝子には、哺乳動物の破骨細胞で発現が認められているものもあるが、エストロゲンとの関係が未だ明確になっていないものもあった。したがって、骨髄骨の破骨細胞で見出されたエストロゲン応答遺伝子の解析は、哺乳動物の破骨細胞のみならず骨代謝の研究にたいへん有意義な結果をもたらすと考えらえる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２７年度のおける研究計画では、鳥類骨髄骨の破骨細胞を用いたDNAマイクロアレイ解析で得られた結果から、エストロゲン応答遺伝子を同定することとしていた。鳥類骨髄骨の破骨細胞において、エストロゲン応答遺伝子の候補遺伝子が見出された。当初は、エストロゲン応答遺伝子の発現抑制などによる骨髄骨破骨細胞の分化や機能への影響を検討した後、哺乳動物の破骨細胞におけるエストロゲン応答遺伝子の発現等について検討することとしていた。しかしながら、哺乳動物の破骨細胞におけるエストロゲン応答遺伝子の検出および同定を可及的速やかに行なう必要性があると考えられるため、マウスの骨髄細胞を用いた破骨細胞の培養方法の確立を先行して開始した。
マウス破骨細胞の培養方法の確立することで、哺乳動物の破骨細胞におけるエストロゲン応答遺伝子を同定し、その役割を検討することが可能となる。また、鳥類骨髄骨の破骨細胞におけるエストロゲン応答遺伝子の役割について、より詳細に検討する必要性があるとともに、哺乳動物の破骨細胞においてそれらの遺伝子が発現していない、あるいは関与していない可能性もあることから、さらに候補となる遺伝子を見出す必要性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.平成２７年度で得られたエストロゲン応答遺伝子の候補遺伝子の骨髄骨破骨細胞への役割をさらに解析するために、これらの遺伝子のRNAiによる発現抑制、あるいは翻訳されるタンパク質の中和抗体や阻害剤による発現阻害を行ない、破骨細胞の分化、機能およびアポトーシスに及ぼす影響を検討する。
2.DNAマイクロアレイ解析で得た候補遺伝子の中から、エストロゲン応答遺伝子の同定を継続する。
3.マウス骨髄細胞から破骨細胞を分化させるとともに、分化過程や骨吸収時におけるエストロゲン応答遺伝子とタンパク質の発現をRT-PCR法やウェスタンブロット法などにより検出する。
4.マウス骨髄細胞を用いて、エストロゲン応答遺伝子の発現をRNAiにより抑制、またはタンパク質を中和抗体や阻害剤で阻害し、破骨細胞の分化、骨吸収能およびアポトーシスに及ぼす影響を調べる。さらに、応答遺伝子をアデノウイルスベクターにより過剰発現させ、破骨細胞への影響を同様に検討する。
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