| 研究課題/領域番号 |
15K11033
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| 研究機関 | 福岡歯科大学 |
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研究代表者 |
長 環 福岡歯科大学, 歯学部, 准教授 (90131870)
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| 研究分担者 |
稲井 哲一朗 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (00264044)
田中 芳彦 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (00398083)
成田 由香 福岡歯科大学, 歯学部, 助教 (50758050)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 粘膜感染症 / カンジダ常在マウス / 口腔カンジダ症マウス / 樹状細胞 / T細胞 / IL-17 |
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| 研究実績の概要 |
粘膜は外界に露出しているため多くの病原微生物の侵入経路となりますが、一方で常在微生物叢の存在は免疫機構に特殊性を付与していると考えられています。カンジダはヒトの口腔に常在する真菌ですが、宿主との関係で口腔カンジダ症を引き起こすことがあります。口腔は消化管の入り口として腸管と繋がっているため、カンジダはヒトの腸管にも定着しています。しかしながらマウスでは口腔にも腸管にもカンジダは常在していません。本研究の目的は、口腔粘膜感染症の発症機序を免疫学的に解明することです。そのためにカンジダとマウスを用いて、口腔および腸管の全身的免疫機構の中で粘膜感染症の発症機序を解明し、新しい診断法や治療法の開発基盤を確立することを目指しています。
今年度の研究計画は①宿主の免疫細胞が応答するカンジダの新規抗原を網羅的に探索する。②カンジダ常在モデルマウス、口腔カンジダ症モデルマウスを試作することを目標としています。①のカンジダから抗原性の強い菌体成分を網羅的に探索する実験では、酵母形、菌糸形のカンジダ菌体を全菌体抽出液、可溶性画分、不溶性画分、細胞壁画分に分画しました。これらの画分について、骨髄細胞由来樹状細胞とナイーブT細胞を用いin vitroにおけるヘルパーT細胞のIL-17産生誘導能を評価することで、主要な抗原部位の候補画分の絞り込みを行いました。さらに逆相高速液体クロマトグラフィーカラム、二次元SDS-PAGEによる分析で絞り込みを進め、現在プロテオミクス解析を展開しています。②のモデルマウスの試作のうちカンジダ常在マウスは、抗生物質投与と胃ゾンデ法により腸管に一定期間カンジダが常在することを糞中の菌数で確認しました。口腔カンジダ症マウスは、免疫抑制剤と抗生物質の投与により目視による舌表面の白苔形成を確認しました。
以上の報告のように、今年度の研究計画はほぼ達成されました。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の研究計画は①宿主の免疫細胞が応答するカンジダの新規抗原を網羅的に探索する。②カンジダ常在モデルマウス、口腔カンジダ症モデルマウスを試作することを目標としています。
①のカンジダから新規T細胞のエピトープを同定するために、宿主免疫細胞の応答評価系の確立とカンジダ成分の網羅的解析を行いました。免疫細胞応答評価系として、抗原提示細胞としての骨髄細胞由来樹状細胞とナイーブT細胞を用い、in vitroでのIL-17産生誘導を行ったのちFlowcytometry法で評価する系を確立しました。カンジダ成分の解析実験では、カンジダの酵母形および菌糸形菌体それぞれから全菌体抽出液、可溶性画分、不溶性画分、細胞壁画分と網羅的に分離しました。これらの画分を免疫細胞応答評価系で評価し、主要な抗原部位を含む画分として可溶性画分と細胞壁画分に絞り込みました。次に逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを用い、さらに候補画分の細分化を行い、免疫細胞応答評価系を用いて画分の絞り込みを行いました。この絞り込み画分の二次元SDS-PAGEにより標的スポットを分離し、現在プロテオミクス解析を展開しています。以上のようにカンジダ由来の新規抗原の決定に向け、実験は順調に展開しています。
②のカンジダモデルマウスの試作は、カンジダの腸管常在マウスと、口腔カンジダ症マウスの試作を行いました。マウス腸管へのカンジダの常在は、抗生物質投与および胃ゾンデ法による菌接種を行い、糞中のカンジダ菌数で評価しました。その結果、一定期間カンジダの腸管常在を確認しました。マウスにおける口腔カンジダ症の発症は、免疫抑制剤および抗生物質の投与で誘導し、目視による舌表面の白苔形成、切除舌からの付着カンジダ菌数で評価し、マウスの口腔カンジダ症を確認しました。以上のようにモデルマウスの第一段階の試作は成功したと考えています。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究では①カンジダ由来の新規抗原を決定・単離。②この抗原を利用して、カンジダに応答する全身的免疫機構の解明を進めます。
①新規抗原の決定のためにプロテオミクス解析の結果を踏まえ、先ず大腸菌を利用したオーバーラッピングペプチドを作成できる分子生物学的ツールを構築します。この系を用いて作成されたペプチドを免疫細胞応答系で評価し、最終的な候補抗原タンパクを同定します。
②モデルマウスを用いた全身的免疫機構の解明のために、先ずカンジダの定着部位を確認する実験を行います。視覚的な確認が出来るために蛍光標識あるいは蛍光染色したカンジダを作成し、定着部位の観察を行います。全身的免疫機構の解析を展開するために従来の強い免疫抑制によるカンジダ症誘導ではなく、宿主免疫系への影響が軽減された口腔カンジダ症モデルマウスの構築を目指します。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（次年度使用額が生じた理由と使用計画）
当該年度に計画していた宿主の免疫細胞が応答するカンジダの新規抗原を網羅的に探索する実験計画のうち、最終段階のプロテオミクス解析後、この結果に基づく候補タンパクの作成部分が次年度に移行したため、予算の一部を次年度使用としました。
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| 次年度使用額の使用計画 |
プロテオミクス解析の結果を利用しカンジダ由来の新規抗原を決定するために、大腸菌を用いた網羅的なオーバーラッピングペプチドの作成を行い、抗原決定の達成を目指します。
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