研究課題
骨、軟骨組織の増殖、分化においてさまざまな生理活性因子が関与していることが知られているが、中でもCCN2はその多機能性と作用機構の特殊性で知られる因子である。この因子は38kDaの分泌タンパク質であるが、他の様々な因子と結合してそれらの機能を制御することにより多機能性を発揮するものと考えられている。そこでその結合因子を見いだすことで新たな機能を解明できると考え、結合因子のスクリーニングを行った。その結果見いだしたCD302はレクチン様ドメインを持つ膜タンパク質の一種であり、マクロファージなどでの発現が知られている因子である。今回我々が注目した破骨細胞はマクロファージ系の前駆細胞から分化するにも関わらず、CD302の発現や機能は全く報告されていなかった。そこで我々はこの因子の遺伝子が成熟破骨細胞において発現していることや破骨細胞の成熟に伴って形成されるアクチンリング周辺に多く存在すること、さらにはCD302の発現を抑制すると骨吸収能が低下することを明らかにした。さらにCD302とアクチンの関連について明らかにすべく以下の検討を行った。破骨細胞の分化過程においてsiRNAを用いてCD302の発現を抑制したところ、TRAP陽性の成熟破骨細胞数が減少した。また、この時の破骨細胞の様子をタイムラプス撮影して観察したところ、すでにアクチンリングを形成している細胞ではリングが断片化する様が見られた。また、免疫沈降法によりCD302はアクチンおよびCCN2のそれぞれと結合することも示された。これらの結果から、CD302はアクチンリングの形成に必須であり、アクチンとの結合性がすでに報告されているCCN2とも結合することからCD302、CCN2およびアクチンの三者が協働してアクチンリングを形成している可能性が示唆される。
2: おおむね順調に進展している
概ね計画通りに進行しているが、CD302のシグナル伝達経路については現在、解析を進めている段階であり、いまだ明確な結論は得られていない。また、破骨細胞分化の過程で発現することが知られている複数の因子の遺伝子発現へのCD302の関与についても解析を行ったが、予想に反してCD302の発現を抑制することでDC-STAMPやCathpsinKといった破骨細胞形成の後期分化に必須の因子の遺伝子発現が促進された。これについては追試験を重ねて慎重に検討する必要があると同時に、この現象が確実なものであると分かった場合に破骨細胞の成熟におけるCD302の役割について整合性のある考察を深めておく必要があると考えられる。
CD302の細胞内ドメインにhalf ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif)と呼ばれるアミノ酸配列を有していることが分かったため、これまで予想していたc-Srcやインテグリンavb3のみでなく、ITAMシグナルの下流に位置するSHP-2やSyk、FakなどへのCD302由来シグナルの関与についても併せて検討をすすめる。また、CD302の発現ベクターを作成中であり、これを用いてCD302発現の低いcell lineに強制発現させることでactin ring の形成を促進できるかどうかというgain of functionの実験系を組むことができる。さらにhalf ITAM motifに変異を導入した発現系を用いてCD302の機能におけるこの部分の影響を調べることを計画している。
CD302のシグナル伝達経路として当初、考えていなかったITAMの経路を介している可能性が浮上したため、予定していなかったシグナル経路の解析を行う必要があった。そこで最初に27年度に計画していたCD302の強制発現ベクターの作成とそれを用いたCD302の強制発現による破骨細胞の形態変化などの観察のための時間がなくなり、この実験内容を次年度に繰り越さざるを得なくなったため、そのための費用が未使用額となった。
CD302の強制発現系を立ち上げるだけでなく、前年度の研究結果から示唆されるCD302のITAMモチーフに変異を導入した変異型CD302の発現系も併せて作成し、この配列がCD302の機能に及ぼす影響を検討していく。
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 7件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (6件)
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