重症複合型免疫不全を呈する希少難病（細網異形成症）の病態解明と治療法の開発

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K11072
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 野間 隆文 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (40189428)
• 研究分担者: 谷村 綾子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (10610199) ; 堀口 大吾 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (70304532)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 幹細胞 / ミトコンドリア / エネルギー代謝 / 血球細胞分化制御

研究実績の概要

今年度は、昨年に引き続き、細網異形成症（RD）の病態解明のために、Jurkat細胞への誘導型FoxP3遺伝子導入細胞株の樹立である。その安定細胞株が樹立できれば、それを制御性T細胞(Treg) in vitroモデルとして用い、エネルギー代謝酵素AK2の役割を解明することを目的とした。
これまでに、Jurkat細胞への導入効率が良いとされたTransIT-Jurkat試薬を用いた誘導型FoxP3遺伝子のリポフェクション法で安定的遺伝子株が得られなかったことから、FoxP3導入細胞方法として、エレクトロポレーション後にGFPマーカーで遺伝子導入細胞群を選抜し、その後Puromycinによる薬剤選択のステップを加えた。具体的には、coding領域全長を有するヒトFOXP3cDNA挿入したpTetOne誘導型FoxP3遺伝子発現ベクターを作製した。次いで、Necleofectorを用いて、FOXP3発現ベクターとPuromycin耐性遺伝子のコトランスフェクションを行った。遺伝子導入操作後、Pyuromycin（0.62 μg/mL）による選択を行った。Puromycin選択後の細胞を，限界希釈法により薬剤耐性クローン化細胞を選抜した。その結果、47クローンのうち、細胞増殖に問題のあった２クローンを除き、４５クローンを取得した。それらのクローンについて、Doxycycline添加（100 ng/mL）培養にて、FOXP3遺伝子の発現誘導能を検討したところ、いずれのクローンにおいてもFOXP3遺伝子発現が認められなかった。これまでに確認できたことは、coding領域全長を有するヒトFOXP3cDNAをTet-Onシステムで発現させる場合、splice variant(v2)型に比べ、発現効率が悪いことがわかった。現在この結果の詳細について検討を行なっている。

研究成果

• [雑誌論文] Human AK2 links intracellular bioenergetics redistribution to the fate of hematopoietic progenitors. (2018)
  • 著者名/発表者名: Oshima K, Saiki N, Tanaka M, Imamura H, Niwa A, Tanimura A, Nagahashi A, Hirayama A, Okita K, Hotta A, Kitayama S, Osawa M, Kaneko S, Watanabe A, Asaka I, Fujibuchi W, Imai K, Yabe H, Kamachi Y, Hara J, Kojima S, Tomita M, Soga T, Noma T, Nonoyama S, Nakahata T, Saito MK.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: Volume 497 Issue 2 ページ: 719-725
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.02.139
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] From Molecular Structure and Mechanisms to Cellular Bioenergetics in Health and Disease (2017)
  • 著者名/発表者名: Tanimura A, Miyoshi K, Horiguchi T, Hagita H, Fujisawa K, Noma T
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 国際学会
• [学会発表] ミトコンドリアがUPR活性をコントロールして免疫細胞分化の方向を決定づける (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷村綾子、三好圭子、堀口大吾、萩田浩子、藤沢浩一、野間隆文
  • 学会等名: 第17回日本ミトコンドリア学会
• [学会発表] CRISPR/Cas9を用いたAK2の段階的欠損による細胞代謝への影響 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷村綾子、三好圭子、堀口大吾、藤沢浩一、野間隆文
  • 学会等名: 第２回日本ゲノム編集学会