| 研究課題/領域番号 |
15K11090
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| 研究機関 | 神奈川歯科大学 |
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研究代表者 |
倉田 俊一 神奈川歯科大学, 歯学部, その他 (60140901)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | p63 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
TP63(p63)はがん抑制遺伝子TP53(p53)ファミリー遺伝子の１つであるが、癌での変異頻度は極めて低く、高分化型の頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)で高発現している。p63からは転写活性化能をもつTA型(TAp63)と転写開始点が下流にあるためN末端が短いΔN型(ΔNp63)のアイソフォームが産生される。TAp63はp53と類似する機能を果たし、ΔNp63は癌の悪性化を抑制すると考えられている。p63の機能を詳しく解析するため、CRISPR-Cas9法を用いてアイソフォーム別に欠失させる計画を立て、まずTAp63の第1エクソンの相同組換えによるノックアウトを試みた。
HNSCCでは高頻度にp63領域が増幅しているが、実験に用いたFaDu細胞では増幅がないことをPCRにより確認した。pCas9-Guide プラスミド(RNA標的配列とCas9)およびドナー・ベクター(相同性アーム配列と薬剤耐性遺伝子PuroRカセット)を導入し、エピソームが消失する25日後まで継代を繰り返し、耐性細胞を単離した後、サブクローニングを行った。ゲノムDNAを精製しPCRで解析すると、設計通りの組換えが起こったことが多数の細胞で確認できたが、平成27年度に得られた細胞は全てヘテロ組換え体であった。ホモ組換え体を作成するために、再度プラスミドの導入と薬剤耐性による選択を行っている。
また、ΔNp63の機能の解析では、Wnt/βカテニン応答性遺伝子発現を抑制する機能を検出したが、HEK293細胞においてはβカテニン依存性に転写を促進する場合があった。HEK293細胞ではアデノウイルスのオンコジーンE1aとE1bを発現しており、p63とTCF/LEF、βカテニン、E1aの相互作用をレポータアッセイにより解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TAp63をコードするmRNAの翻訳開始配列AUGをノックアウトしても、mRNAにはいくつものAUGコドンが存在し、他のアイソフォームが翻訳される可能性が高い。そのため、本研究ではTAp63の第1エクソンを相同組換えによりノックアウトし、TAp63のmRNAが合成されないようにする計画を立てた。ドナー・ベクターにより［左アーム・GFP・PuroR・右アーム］が与えられるので、ノックアウトを検出するため数種類のプライマーを設定してPCRを行った。また、組換え細胞を選択するピューロマイシン濃度の調整、薬剤選択の前に5回以上の継代培養を行いエピソームとして存在するプラスミドを除去するなどの工夫を行った。
本年度実施した実験により、p63をTAとΔNのアイソフォーム別にノックアウトする技術の基盤ができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
１. ホモ接合体でのノックアウト細胞を得て、TAp63ノックアウト細胞とする。その細胞を用いて、(1)DNA損傷への応答、(2)遺伝子発現への影響 を解析し、TAp63アイソフォームの口腔扁平上皮癌における機能を明らかにする。
２．同様の方法によりΔNのノックアウト細胞を作成する。(1)悪性転化（分化能の消失）(2)遺伝子発現への影響を解析し、ΔNp63が癌の悪性化を阻害する機構について検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2倍体細胞(FaDu)に対して、ゲノム編集を行ったが、2つ存在するp63アレルの片方のみが編集された細胞しか得ることができなかった。そこで、もう一方のp63アレルに対して再度ゲノム編集を行うこととなったので、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Origene社のgenome-wide knockout kit using Crispr を用いる。pCas-quide プラスミド(gRNAベクター)にエキソン1 (TAp63の破壊) またはエキソン3’ (ΔNp63の破壊) の転写開始点のguide配列を挿入するとともに、puromycin耐性遺伝子カセットを含むドナーベクターを構築する。puromycin耐性細胞を選択する。選択細胞からゲノムDNAを精製し、PCR法により策定部位にドナーカセット配列が挿入されていることを確認する。数種のguide配列とdonor配列の組み合わせを試みる。Creベクター導入によりPuroを欠失させ、もう一方のアレルに関して同様の操作を行う。これらの研究のために次年度使用額を用いる。
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