| 研究課題/領域番号 |
15K11131
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
神尾 直人 日本大学, 松戸歯学部, 助教 (10508774)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ヒト歯髄培養細胞 / カリクレイン / PAR-1 / COX-2 / 炎症 |
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| 研究実績の概要 |
本申請の目的は、ヒト歯髄培養細胞においてカリクレインのPAR-1活性化を介したCOX-2産生機序、およびプラスミンやブラジキニンとの相互ネットワークの存在を明らかにすることにある。初年度にはまずカリクレインのCOX-2産生機序を報告済みのプラスミンと比較しながら明らかにする計画であった。具体的には、カリクレイン作用時のCOX-2 mRNA発現（リアルタイムPCR法）、タンパク質発現（Western Blot法）およびNFATc1のDNA結合活性を可視化することを目的としてGel shift assayを行う。また状況によってプラスミンやブラジキニンとの相互作用についても検討を開始する。
まずリアルタイムPCR法にてカリクレインはCOX-2ｍRNAの発現を濃度依存的、時間依存的に上昇させることを確認した。またこれは確認済みであったRT-PCRと同様の結果であった、つぎにウェスタンブロット法にてタンパク質発現についても検討し、カリクレインによるCOX-2タンパク質発現の促進を確認した。またいずれもPAR-1阻害剤により効果は抑制された。さらに培養上清中に放出されるPGE2に関しても同様の傾向があった。上記結果はJ Cell Biochemにて報告した。
Gel shift assayに関しては計画とは異なり非アイソトープで行うこととし、現在準備段階にある。同時に、ブラジキニンとの相互作用に関する実験も開始し細胞内カルシウムイオン濃度変化についてデータの収集を行っている。
また、カリクレイン同様にPAR-1活性化に関与する可能性のあるセリンプロテアーゼを模索し、Neuropsinがヒト歯髄培養細胞でCOX-2発現に関与する可能性について日本歯科保存学会学術大会にて報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度の計画の多くは達成されており、計画中に含まれたGel shift assayも準備段階ではあるが進行していること。替わりに相互作用に関するデータの収集を開始できていること、さらにデータの一部で論文投稿が完了していることから、おおむね順調であるといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画どおり、プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる相互作用の可能性の検索および[Ca2+]iの上昇機構の詳細な検索を行う。
特に[Ca2+]iの上昇機構の検索に関しては過去にプラスミンとCa2+-ATPase阻害剤であるThapsigargin存在下での検討を行い要領を得ている。今回は細胞膜カルシウムイオンチャネルの阻害剤の効果を検討を行う。また細胞内カルシウムイオンの標的タンパクであるPKCの動態は非常に重要であると考えられる。calcineurin-NFATシグナルだけでなくPKC活性化についても同時に検索を行ったほうが効率的であり、進行状況によってはPKC動態やPMAにより活性化することによる相乗効果の検討への変更を考える。
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