2016 年度実施状況報告書

p53ノックアウトマウス人工授精凍結胚を用いた口蓋裂発生メカニズムの解析

研究課題

研究課題/領域番号	15K11237
研究機関	新潟大学
研究代表者	児玉泰光新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (90419276)
研究分担者	大峡淳新潟大学, 医歯学系, 教授 (40266169)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	口蓋裂
研究実績の概要	口蓋突起の挙上、水平方向への突起の成長、口蓋突起の癒合という口蓋形成における形態変化は、マウスの場合１日で生じる。そのため、授精時期を厳密に管理でき、研究データのばらつきも減少させられる方法として、凍結授精胚の応用を本研究では採用した。しかし、予定よりも凍結授精胚からの胎仔の獲得数が少なかったため、前年度に、通常交配でのvaginal plugと胎仔の体重を併用した新たな授精時期の判定による胎仔獲得を、凍結授精胚の応用実験と平行して行い、一定数の胎仔の獲得が可能となった。妊娠8日、9日、10日目にγ線照射を行い、妊娠19日目で妊娠マウスを安楽死させ、開腹にて胎仔を摘出し、口蓋裂のみを示すマウス、口唇・口蓋裂の両方を示すマウスを既に獲得し、それぞれの解析を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由前年度、凍結受精胚からの胎仔の獲得数が少なく、保管する凍結受精胚の数量にも限りがあるため、通常交配による胎仔獲得を併用する方策を講じた。通常交配のためにCL-Fr成獣の数量を増やす必要があったものの、多くのCL-Fr母親マウスの飼育放棄や食殺行為のため、予定していた数に達するまで多くの時間を要した。
今後の研究の推進方策	口蓋裂のみ示すマウス、口唇裂と口蓋裂両方を示すマウスをヨード染色した後に、マイクロCTで解析し、口唇裂、口蓋裂の形態を３次元的に把握する。さらに口蓋裂のみ示すマウス、口唇裂と口蓋裂両方を示すマウス間での、Meox2, Shox2, Pax9, Msx1, Osr2などの口蓋形成関連遺伝子、p53関連遺伝子であるp21、GADD45、Bax、MDM2遺伝子発現の差を、in situ hybridization, 免疫染色、ウェスタンブトットなどで検索する。また、Shh, Fgf, Wnt, Tgfなどのシグナル経路の活性も確認する。
次年度使用額が生じた理由	必要なマウス数の獲得に時間を要した関係で、使用できなかった旅費、消耗品が生じた。
次年度使用額の使用計画	次年度は、前述した推進方策にしたがい、必要な実験動物、試薬等の消耗品類を購入する。また、国内外の学会における成果発表の旅費に充てる