| 研究課題/領域番号 |
15K11251
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
虎谷 茂昭 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 准教授 (90172220)
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| 研究分担者 |
岡本 哲治 広島大学, 医歯薬学保健学研究院(歯), 教授 (00169153)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 癌幹細胞 / CD133 / 口腔癌 / 無血清浮遊培養 |
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| 研究実績の概要 |
がん幹細胞は、がん治療における新たな標的細胞として注目されている。CD133 は癌幹細胞の有力なマーカーとして考えられており、本研究では、ヒト口腔扁平上皮癌OSCC 細胞株由来 CD133 陽性細胞(CD133+細胞)の機能解析について検討する予定である。
OSCC親株（KO、NA、UE）をマグネティックビーズ付抗CD133抗体で処理後autoMACS（ミルテニー）を用いてCD133+細胞を分離した。CD133蛋白の発現を免疫組織学的に検討し、本分離方法によりCD133陽性細胞（CD133+）が再現性よく分離されていることを確認した。さらにCD133+細胞の全細胞中に占める細胞数の比率はわずか約0.5%であることを明らかにした。
CD133+細胞は通常の単層培養系ではCD133-細胞や親細胞に比べ低い増殖能であった。また無血清培養下、CD133+細胞と CD133-細胞間で浮遊培養系での浮遊細胞塊（sphere）形成能を比較した結果、CD133+細胞は浮遊培養系で高いsphere 形成能を示したが、CD133-細胞のみでは sphereをまったく形成しなかった。培養開始時に、CD133-細胞に CD133+細胞を加えることでsphere 形成能を獲得した。興味あることに、sphere数および大きさがプラトーとなった時のsphere中のCD133+細胞の占める割合は親細胞株におけるCD133+細胞の比率と同等の0.5%であった。
またsphere形成能をもつCD133+細胞とsphere形成能を持たないCD133-細胞を各々浮遊培養後、10乗個の細胞をヌードマウス背部皮下に移植すると、CD133+細胞を含むsphereは、腫瘍の形成を認めたが、CD133-細胞のみでは腫瘍は形成できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在、研究はほぼ順調に実施している。しかし、CD133+細胞が全細胞中0.5％しか存在しないこと、分離したCD133+細胞を維持しているとCD133-細胞にトランジットしてしまうことから、大量の細胞を必要とするin vivoの研究では、細胞の供給、選別に大きな負担を感じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
骨肉腫幹細胞の系ではsphere形成にTGF-β1の関与を(Zhang et al.2013)示唆する報告がある。我々の研究では、sphere形成にはCD133+細胞が必要であり、そのCD133+細胞がCD133-細胞と凝集することでsphere形成が開始する可能性が示唆された。このような機構にはCD133+細胞が産生する液性因子・細胞増殖因子がパラクライン的に関与している可能性が考えられる。そこで今年度はCD133+細胞やCD133-細胞が産生する液性因子がsphere形成能に及ぼす影響について明らかにし、sphere形成能に及ぶすCD133+細胞とCD133-細胞の細胞間ネットワークやCD133+細胞やCD133-細胞が産生する液性因子の生物学的特性に及ぼす影響やそのについて解析する。
まずCD133＋細胞とCD133-細胞の遺伝子、蛋白発現についてDNAマイクロアレイ、プロテオーム解析により相違を明らかにする。さらに、これらの液性因子および受容体遺伝子に対する中和抗体やsiRNAを用いて、CD133+細胞およびCD133-細胞での遺伝子発現をノックダウンし、それぞれのsphere形成能やその他の生物学的特性を解析することにより同定した液性因子の機能を明らかにする。
そしてヌードマウスの皮下移植モデルを用いてsphereと同定した液性因子を混合した後に移植し、形成された腫瘍の動態や、その浸潤能および転移能を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
CD133+細胞の大量培養にやや時間が要するため、in vivo の研究に使用するヌードマウスの購入を控えていたこと、蛋白発現をみるプロテオーム解析や免疫染色の準備がまだできていないためた抗体や薬品の購入がまだ行えていないことが理由である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
CD133+細胞あるいはCD133-細胞が産生する液性因子・細胞増殖因子がパラクライン的に関与している可能性が考えられる。
従って、これらの細胞が産生する液性因子と液性因子受容体の分析と、同定された因子によるCD133+細胞によるsphere形成能の亢進、腫瘍細胞の増殖および造腫瘍性への関与などの生物学的特性に及ぼす影響についても明らかにする。そのために必要な、これら同定された因子に対する抗体の購入と造腫瘍性の検討のための動物の購入を予定している。
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