| 研究課題/領域番号 |
15K11315
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
永井 宏和 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (50282190)
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| 研究分担者 |
宮本 洋二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (20200214)
玉谷 哲也 徳島大学, 病院, 講師 (30274236)
藤澤 健司 徳島大学, 病院, 講師 (40228979)
大江 剛 徳島大学, 病院, 助教 (60432762)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 骨再生 / 炭酸アパタイト / コラーゲン / iPS細胞 |
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| 研究実績の概要 |
① 低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製：低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体は低結晶性炭酸アパタイト顆粒とコラーゲン溶液を混和した後，円柱状金型に炭酸アパタイト・コラーゲン混合液を充填し，凍結乾燥して作製した．複合体作製条件として，炭酸アパタイト顆粒の大きさ（顆粒径），混和するコラーゲン溶液の濃度，炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比について検討した．顆粒径は300－600 マイクロm（Sサイズ）と600－1000 マイクロm（Mサイズ）の２種類とし，コラーゲン溶液の濃度は３％，炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比は50%と65%という条件で複合体を作製することとした．
② 炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植：SサイズとMサイズの２種類の顆粒を用いて，埋植用の炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を４種類（50S, 65S, 50M, 65M）作製した．試料をウサギ頭頂骨に埋植し，8週後に摘出して組織学的評価を行った．骨欠損部に試料が緊密に埋植されている個体では骨形成は良好であったが，顆粒が骨欠損部外へ分散してしまった個体では骨形成が不十分であったことから，作製した複合体の操作性と安定性に問題があることが明らかになった．そこで，熱架橋を行った４種類の複合体（50S, 65S, 50M, 65M）を埋植したところ，骨形成には影響はなく，操作性と安定性の改善が得られた．
③ iPS細胞の骨芽細胞への分化誘導：理化学研究所から購入したヒトiPS細胞（HPS0002）を実験に用いた．まず，iPS細胞をマウス胎仔線維芽細胞（MEF）をフィーダーとして培養を行い，十分な細胞ストックを作成した．次いで，レチノイン酸を添加してiPS細胞を培養した後，骨芽細胞分化培地で培養して，骨芽細胞への分化誘導を行った．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は，低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製条件として，炭酸アパタイト顆粒の大きさ（顆粒径），混和するコラーゲン溶液の濃度，炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比について検討した．顆粒径は300－600 マイクロm（Sサイズ）と600－1000 マイクロm（Mサイズ）の２種類，コラーゲン溶液の濃度は３％，炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比は50%と65%という条件を見出した．さらに，炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植実験を行った．骨欠損部に試料が緊密に埋植されている個体では骨形成は良好であったが，顆粒が骨欠損部外へ分散してしまった個体では骨形成が十分ではなかったことから，作製した複合体の操作性と安定性に問題があることが明らかになった．そこで，埋植用炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を熱架橋処理して埋植したところ，骨形成には影響はなく，操作性と安定性の改善が得られた．iPS細胞の骨芽細胞への分化誘導については，分化誘導の効率が低く，予定通りには進んでいない．
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では，生体骨がコラーゲンと炭酸アパタイトを主成分とする有機・無機複合体であることから，申請者らが開発した新規生体吸収性材料である低結晶性炭酸アパタイトとコラーゲンを複合化させた新しい骨再生用scaffoldを開発しようと考えた．現在の低結晶性炭酸アパタイトは顆粒状やブロック状であり，賦形性や操作性に問題があったが，コラーゲンと複合化することで，これらの問題点が改善できると考えている．そしてこの骨再生用scaffold とiPS細胞由来の骨芽細胞と組み合わせたハイブリッド型人工骨を創製して新しい骨再生医療を目指す．低結晶性炭酸アパタイトとコラーゲンの複合化は，炭酸アパタイトの顆粒径やコラーゲン濃度，炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比，熱架橋など種々の条件を検討し，炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製には成功している．また，種々の条件で作製した炭酸アパタイト－コラーゲン複合体の埋植実験も行っており，骨再生能力の評価を行っているところである．今後の課題としては，炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を用いたハイブリッド型人工骨の細胞ソースとなるiPS細胞の間葉系幹細胞への分化誘導および骨芽細胞への分化誘導の効率を上げることが重要であり，引き続き検討していく予定である．この分化誘導では，iPS細胞をLIF非存在下に血清を用いて培養して分化を誘導する．培養4日目に，PDGFRα陽性, VEGFR2陰性の分画をFACSでソートして培養し，さらにCXCR4を用いてソートして間葉系幹細胞を純化していく予定である．この分化誘導実験が上手くいけば，iPS細胞由来の間葉系幹細胞あるいは骨芽細胞を炭酸アパタイト・コラーゲン複合体で培養し，炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を用いたハイブリッド型人工骨を創製する
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では，申請者らが開発した新規生体吸収性材料である低結晶性炭酸アパタイトとコラーゲンを複合化させた新しい骨再生用scaffoldを開発し，これとiPS細胞から分化させた間葉系幹細胞（あるいは骨芽細胞）と組み合わせることで，ハイブリッド型人工骨を作製して新しい骨再生医療の可能性について検討する予定である．平成27，28年度は，iPS細胞の培養と低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製を行った．低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の埋植実験は順調に進んでいるが，組織学的な評価がまだ行えていない．iPS細胞の分化誘導実験が思うように進んでいないため，平成29年度にこれらの費用が繰り越されることになった．
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度に繰り越された費用は，低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の埋植実験の組織学的な評価，およびiPS細胞の間葉系幹細胞あるい骨芽細胞への分化誘導実験に使用する予定である．
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