| 研究分担者 |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医療ミニブタ先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、歯の形成不全の発生機序の解明のために、次世代ノックアウト（KO）技法を用い、乳歯髄細胞内の標的遺伝子を効率的に破壊し、歯構成細胞への分化誘導後の細胞の機能を検討することである。
そこで、まずは次世代型KO技法である、CRIPR/Cas9システムの動作確認のために、α-1, 3-GalactosyltransferaaseをKOしたブタ胎児線維芽細胞を作製したところ、薬物耐性を有するKO細胞株の樹立が可能であった。
また、pCGsap1/DSPP, pTrans, pT-EGFP, pT-Hyg発現ベクターを作製し、乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入を行ったところ、20％程度の遺伝子導入株を確認することができた。
さらに、Cas9とdentin sialophosphoprotein(Dspp)遺伝子を標的としたguide RNAを同時に発現するベクターと、Hygromycin B耐性遺伝子発現ベクターと、EGFP蛍光遺伝子発現ベクターを、electroporation systemを用いて、歯髄細胞に共遺伝子導入した。１回目の実験では、遺伝子導入後の細胞をHygromycin Bでセレクションした後、濃縮株についてゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。続いて２回目の実験を行い、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子上の変異誘導効果について検討した。
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