| 研究課題/領域番号 |
15K11381
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
岩崎 剣吾 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座講師 (40401351)
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| 研究分担者 |
小牧 基浩 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (30401368)
森田 育男 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (60100129) [辞退]
和泉 雄一 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (60159803)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 再生 / 歯周病 / 幹細胞 / 動物実験 |
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| 研究実績の概要 |
我々は平成27年度の研究を研究実施計画に則って継続した。理化学研究所より入手した不死化細胞株UBE6T-7, UE6E7-12, UE7T-13は分化の傾向が異なる事が明らかとなったため、そのうち最も分化能力の高かったUET-13を選択し培養上清中のタンパク量をELISA法を用いて測定した。その結果、皮膚由来線維芽細胞の培養上清と比較してVEGF, bFGF, TGF-bが高濃度に含まれている事が認められた。また、ヒト抜去歯から培養した歯根膜幹細胞(PDLSC)について同様に測定したところ、皮膚線維芽細胞に比べてMCP-1, VEGF, bFGFの濃度が高値を示した。これらの結果は間葉系幹細胞培養上清が細胞増殖や血管新生を促す可能性を示していると考えられたため、各種培養上清を歯周組織再生に関与すると考えられる細胞種である骨芽細胞、セメント芽細胞、血管内皮に作用させたところ、UET-13の培養上清は細胞増殖に影響を与えなかったが、PDLSCの培養上清は骨芽細胞、セメント芽細胞、血管内皮細胞の増殖を増強する結果を示した。ここで我々はPDLSC培養上清に焦点を絞りさらにタンパク成分の解析をLC-MS/MS、プロテインアレー法を用いて詳細に検討を行った。その結果、PDLSC培養上清が最も多く含むタンパク成分はコラーゲンやファイブロネクチンなどのマトリクスタンパクである事、そして微量でも作用することが予想される増殖因子についてはSerpin E1、TIMP-1、Pentraxin 3、uPA、VEGF、Angiogenin、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、MCP-1などが多く含まれることが見いだされた。次に、PDLSC培養上清をラット下顎臼歯頬側に作成した歯周組織欠損へ埋植し、組織再生量をマイクロCT、組織切片を用いて観察したところ、移植後4週後において有意に組織再生量が増強されていた。この結果は、PDLSC培養上清の歯周組織欠損への移植が歯周組織の再生を促す事を示していると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は不死化された間葉系幹細胞細胞株UBE6T-7, UE6E7-12, UE7T-13,およびヒト抜去歯から単離培養したPDLSCの培養上清中の成分の解析を行った。本研究課題の大きな目的の一つは培養上清による歯周組織再生のメカニズムの解明であり、培養上清による組織再生は含まれるタンパク成分に依っている可能性が高いため、本実験は非常に重要であると考えられる。結果として間葉系幹細胞であるUET13やPDLSCは同じ間葉系の細胞である線維芽細胞に比べて特徴的なタンパク成分を含有する事が明らかとなった。さらにPDLSCについて詳細に検討した結果、種々のマトリクスタンパク、増殖因子、血管新生因子が多く含まれる事が示された。これらの結果から、幹細胞培養上清による再生のメカニズムを一部ではあるが考察することが可能となる。しかし、メカニズムの直接的な解明は動物実験において再生局所で起こっている現象を詳細に観察する必要があるため、今後は動物実験を積極的に行ってゆく必要がある。網羅的なタンパク質の解析については、当初の予定ではもっと時間が掛かると予想していたが、実験自体が迅速に進んだため予定より早く結果を得る事が出来た。そのため、サンプル数を増やすなど実験結果の信頼性を高める工夫をする事が出来た。また、実験および解析に時間が掛かると思われる動物実験についても、本年度に大まかな結果が得られ、さらに実験方法についても実験室内で確立することができたため、来年度以降の動物実験のスピードアップにつながると思われる。以上のような状況より、研究はおおむね順調に進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に明らかとなった培養上清中に含まれる因子の数々は、培養上清による組織再生のメカニズムを知るうえで非常に重要である。過去の報告では間葉系幹細胞の培養上清は抗炎症作用、抗アポトーシス作用、細胞増殖促進、細胞遊走促進、血管新生など様々な作用を持つことが示されており、今後これらの作用についてメカニズムの解析を行う。具体的にはin vitroにおいて、再生局所で培養上清が作用すると考えられる細胞種、例えば骨芽細胞、セメント芽細胞、血管内皮細胞、単球/マクロファージなどを用いて、各細胞が培養上清存在下において機能にどの様な変化があるかを検討する予定である。また、それらの機能変化が実際にin vivoにおいて起こっているかどうかについても確認する必要があると考えている。
本年度はPDLSC培養上清の移植によって歯周組織再生が増強することが確認されたため、この実験方法を用いて再生が起こっていると考えられる歯周組織中での検討を継続する予定である。具体的には、培養上清移植後の様々な時間経過時点において、治癒途中の組織を回収し遺伝子発現を指標に再生過程に、培養上清移植がどのような変化をもたらすのかについて明らかにする必要があると考える。それによって培養上清による再生メカニズムの一端が明らかになると思われる。
また、培養上清による歯周組織再生のヒトでの臨床応用を視野に入れた場合、現在行っているラットでの実験を越えて中・大型動物での同様の研究が必要であると考えられるため、この実験についても計画中である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度は予定額110万円であったが、そのうち61097円を次年度へ繰り越す事となった。額としては比較的少額と考えられ、予算執行はほぼ予定通りおこなっていると考える。今年度はタンパクの網羅的解析や動物実験など、費用の掛かる研究を多く手掛けたため、出来る限り消耗品の出費が少なくなるように、無駄を省く工夫をしながら研究を行った。
また、平成29年度は当初より予算額が少なく、さらに多くの動物実験や論文作成にかかる費用などが予想されるため、出来る限り出費をおさえたのが、若干の次年度使用学が生じた理由である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度もこれまでの2年間の継続的な研究を行う。具体的には、実験に使用する細胞培養のための消耗品購入、遺伝子・生化学解析のための消耗品の購入が必要と考えられる。また、一年を通して動物実験を行うため、動物の購入、飼育に多くの研究資金を使用する。
さらには、最終年度であるため、研究成果の発表や論文作成の費用、英文添削、印刷費用などが必要になる予定である。
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