| 研究課題/領域番号 |
15K11403
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
林 潤一郎 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (30350937)
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| 研究分担者 |
内記 良一 愛知医科大学, 医学部, 講師 (10434622)
福田 光男 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40156790)
三谷 章雄 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (50329611)
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| 研究期間 (年度) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| キーワード | 歯周病原細菌 / 唾液細菌叢 / 咽頭細菌叢 / 咽頭上皮細胞 / 咽頭常在菌 |
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| 研究実績の概要 |
歯周病の治療において、歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalis（以下P. gingivalis）の抑制は重要な項目であるが、口腔内から完全に同菌を排除することは難しく、一時的には検出限界以下まで抑制したとしても、一定期間後には再定着を生じる。本研究課題では咽頭部に生息する同菌が口腔内へと流入し再定着を促す一因となっていると仮定し、咽頭部細菌叢と口腔内細菌叢の比較という細菌叢解析と、咽頭部において同菌が排除もされず炎症も生じずに定着が可能となっているメカニズムの考察という細胞応答解析の二方向からの研究を進めている。
これまでに、細菌叢解析については、健常者より唾液、咽頭サンプルを採取し、T-RFLPによる細菌叢解析を行った。クラスター分析の結果、唾液中の歯周病原細菌の検出率は、平均歯周ポケット深さの深いクラスターで高い傾向にあったが、咽頭部ではその傾向はなかった。
本年度においては、咽頭サンプル、及び唾液サンプルから代表的なサンプルにて16Sクローンライブラリーの作成を行った。現在それぞれのクローンの塩基配列の決定を行っている途中であり、今後各々のT-RFに相当する菌種の類推を行っていく予定である。
細胞応答解析については、ヒト咽頭由来の株化上皮細胞であるDetroito562細胞を用いて、P. gingivalisのLPSによる刺激実験を行っている。IL-8を指標にして炎症応答を調べたところ、同細胞はP. gingivalis LPS刺激により濃度依存性にIL-8を産生することが確認された。
今後は、咽頭常在菌による全処理が、このIL-8産生を抑制するかどうかについて、検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
細菌叢解析、細胞応答解析共に進捗は遅れている。細菌叢解析については、健常者サンプルは集まったものの、歯周病サンプルやその他の被験者のサンプルの収集が遅れており、健常者サンプルの解析しかできない状況になっている。これは咽頭サンプル採取を行っていた耳鼻咽喉科医が連携研究者から外れて行こう、新たなメンバーが参加しておらず、サンプリングが難航していることによる。
一方、細胞応答解析については、新たに入手したヒト咽頭上皮細胞の培養が想定外に困難であり、安定して培養できるようになるまで時間を要したことで、研究が大幅に遅れた。また、当初予定していたTNF-αやIL-1βは、P. gingivalisのLPSの刺激では上皮細胞からの産生が低いことが判明し、指標をIL-8に変えるなどの変更を行ったこともあり、進捗が滞っている。研究計画時に想定していた咽頭常在菌はStreptococcus salivaliusであるが、咽頭部での存在比率等でより常在菌としてのポピュレーションを維持している菌種の方が、モデルとして適当であると判断したため、現在、使用する菌種の選定を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、細菌叢解析については、健常者以外のサンプル収集ができないため、健常者サンプルのみを用いて解析を進めていく予定である。具体的には、咽頭部サンプルの細菌叢をクラスター分析によって群わけし、各種臨床パラメーターや唾液中の細菌叢データを比較し、各クラスターにおける特徴的な表現形を調べていく。また、各種クラスターの代表的なサンプルから16Sクローンライブラリーを作成、クローンの塩基配列を決定し、各々のT-RFに相当する菌種を推定することで、各クラスターの細菌叢の特徴を調べていく計画である。
細胞応答解析においては、まず、咽頭常在菌の選定を行う。それを咽頭上皮細胞に反応させ、その後P. gingivalis LPSにて刺激し、IL-8の産生が見られるかどうかを確認する。咽頭常在菌による前処理がP. gingivalis LPS刺激によるIL-8産生の抑制を抑制した場合、その抑制現象において、どのような因子が作用しているのかを検討する予定である。研究分担者らの研究により、血管内皮細胞においてはTGF-βがLPSに対する応答性を抑制し、トレランスを誘発していることが確認されていることから、咽頭常在菌の作用で咽頭上皮細胞からTGF-βが産生されることを確認できれば、TGF-βによる前処理がP. gingivalis LSP刺激によるIL-8産生を抑制するかについて検討を加えていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２８年度に使用したのは、咽頭上皮細胞及び細胞培養試薬、クローニング試薬等が中心である。全体的に研究の進捗に遅れが生じており、そのため研究経費の使用が進んでいない。
特に細胞応答解析のために購入する予定であった、TLR作動薬等の各種リガンドや、サイトカイン産生確認用ELISAキット、各種活性測定キットなどを購入しておらず、予定していた研究費の多くを使用していないため、２９年度へ持ち越すこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
細菌叢解析においては、T-RFLP解析、クローンライブラリ作成及び塩基配列決定に関連した試薬、キットを中心に研究費を使用する予定である。これらのデータ解析のため、新たにPCと解析ウェアを購入する必要が生じる可能性もある。
細胞応答解析については、咽頭常在菌の購入、細胞培養関連試薬、TLR作動薬等の各種リガンド、サイトカイン産生を確認するためのELISAキット、各種活性測定キット、Western blot関連試薬等の購入を予定している。
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