| 研究課題/領域番号 |
15K12252
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
山本 真司 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (50607348)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | トキシンアンチトキシンシステム / アグロバクテリア |
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| 研究実績の概要 |
本研究はトキシンアンチトキシンシステム(以下TAシステム)を細菌の生育制御に応用することを目的としており、本年度はまず、アグロバクテリア内で有効に機能し得るTAシステムの選抜とTA遺伝子誘導条件の検討を行った。本計画はアグロバクテリアによる植物形質転換操作への適用を念頭に置いているため、アグロバクテリアの生育抑制システムとして機能し得るTAシステムの活用を第一の目的としている。
Toxin-antitoxin database(http://202.102.12.135/TADB2/index.php)上のTA finderというツールを用いて、Rhizobium属4種10株のゲノム及びプラスミド上に228組のTAシステム候補遺伝子を推定した。これらトキシン候補遺伝子について、それぞれがコードしているタンパク質のconserved domainを検出しそれに基づいて分類した。その結果、多くの推定トキシンタンパクは作用機序が既知の7グループと機能未知の5グループに分類された。これら12のグループについてそれぞれ各グループ内で最も保存性の高いものを選抜した。このうちから3種(parDE, ietAS, tiorf24-25)を選び、ラクトースプロモーターの下流にクローニングしたプラスミドを作成した。作成したプラスミドを大腸菌及びアグロバクテリアに導入し、生育抑制を効果的に引き起こすIPTG濃度など諸条件を検討した。適切に設定した誘導条件で上述3種のTAシステムについて生育抑制効果を調べたところ、それぞれ異なる生育抑制効果を示した。また、同じSD配列を付した同じ作用機序のTAシステムでも由来する生物種が異なるとその生育抑制効果は大きく異なることが示された。従って、有効な生育抑制効果を得るためには、由来する生物種についても検討の余地があることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
進捗は概ね予定通りであるが、予想以上に多くの種類のTAシステムがRhizobium属ゲノム上に検出されたため、その有効性を測るためのTA遺伝子発現誘導の条件検討について一部前倒しで行っている。従って、TAシステム発現誘導に用いるプロモーターの検討については一種類しか行っていないが、研究計画全体としては予定通り進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究実施計画に基づき、「TAシステムの発現と生育抑制の評価」「植物の形質転換に用いるアグロバクテリアにTAシステムを組み込む」「形質転換後の植物組織に残存する生細胞の確認」を順次行う。
具体的にはまず平成27年度中に至適化された誘導条件をもとに、各種プロモーターのアグロバクテリア内での誘導能力と各種TAシステムの生育抑制効果を確認する。由来生物種によって同種のTAシステムでも生育抑制効果が大きく異なる場合があることがわかったため、予定よりも多くのTAシステムを試す必要がある。一通り確認が終わった後、厳密な生育抑制・細胞死の計測、トキシン耐性獲得変異体出現率を調べる。次に、効果的な生育抑制効果を示したTAシステムを組み合わせた「生育制御TA遺伝子クラスタ」を構築する。これらをアグロバクテリアに導入し、植物形質転換操作後の残存生菌数への影響を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画申請時に計上していた直接経費に対して、実際に交付された助成金額は減額されていたため、設備備品費での機器の購入を一部見送った。また、消耗品に関しては既存物品の利用やキャンペーン割引等を活用することによって支出を抑制し、使用額の余剰が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画申請時に設備備品費での購入を考えていた機器（振盪培養機や恒温器）に関しては、既存の機器で代用しているが、必要に応じて追加購入する。消耗品に関しては、バクテリアおよび植物の培養に必要な培地・試薬等、また一般的な分子生物学的実験のための各種試薬の購入を予定している。その他、オリゴDNA合成やシーケンス等の経費、実験補助の人件費、情報収集・成果発表のための出張旅費等の支出を予定している。
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