| 研究課題/領域番号 |
15K12738
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
坂口 和靖 北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00315053)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 翻訳後修飾 / 脱リン酸化 / ホスファターゼ / ペプチドライブラリー |
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| 研究実績の概要 |
PPM1ファミリーに属するILKAPホスファターゼは、癌細胞の特色である足場非依存的な細胞増殖を抑制する癌抑制タンパク質として注目されている。しかしながら、現在までILKAPに対する細胞内標的因子ばかりでなく、特異的基質配列さえも不明であり、その解明が急務となっている。本研究では、『新規な配位金属制御に基づく基質トラッピング法』を開発し、癌抑制ホスファターゼILKAPの特異的基質配列および細胞内標的を同定することを目的とする。
本年度は、in vitro 脱リン酸化活性測定により、PPM1ファミリーはZnイオンが存在する場合脱リン酸化活性が抑制されることを明らかにした。この結果から、Zn2+が活性中心の金属イオンとして配位し、脱リン酸化活性を示さないZn-PPM1複合体構造を取ることが示唆された。そこで、酵素に基質を捕捉させ、酵素に結合させたGSTタグを用いた精製によって基質を取得する、Metal-dependent Substrate Trapping法をデザインした。
in vitro基質および生体内基質が既知であるPPM1AをMetal-dependent Substrate Trapping法のモデルホスファターゼとして選択し、Znイオン存在下において、基質リン酸化ペプチドp53(20pS)および非基質リン酸化ペプチドp53(15pS)の混合物に対し、Substrate Trappingを実施すると、基質リン酸化ペプチドp53(20pS)が特異的に検出され、Substrate Trappingが可能であることが示された。また、ペプチド混合物に脱リン酸化生成物p53(20S)を加えると、p53(20S)も検出され、PPM1ファミリーにおける生成物阻害の新しい可能性を見出した。また、リン酸化ペプチドライブラリーを合成し、HPLCおよびMALDI-Tof Massにより分析し、その多様性について評価した。さらに、ペプチドライブラリーに対するSubstrate Trappingを実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画の各項目において、おおむね当初計画どおりに実施されている。また、本研究によりPPM1ファミリーの生成物阻害の機構解明の糸口が見出された。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初計画どおりに、研究を進めていく。また、本研究により見出した生成物阻害機構についても注目し、研究を展開していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画どおりに使用したが、端数が残ったものである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
おおむね当初予定どおりに使用する。
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