|
PPM1ファミリーに属するILKAPホスファターゼは、癌細胞の特色である足場非依存的な細胞増殖を抑制する癌抑制タンパク質として注目されている。しかしながら、現在までILKAPに対する細胞内標的因子ばかりでなく、特異的基質配列さえも不明であり、その解明
が急務となっている。本研究では、『新規な配位金属制御に基づく基質トラッピング法』を開発し、癌抑制ホスファターゼILKAPの特異的基質配列および細胞内標的の同定を目指している。
昨年度デザインした亜鉛イオンを用いるMetal-dependent Substrate Trapping（金属イオン依存性サブ基質トラッピング）法の各種パラメーターについて条件最適化を実施した。その結果、適切なbufferやwashingなどの条件を得た。また、リン酸化ペプチドの定量化法についての検討を実施した。なお、ペプチドライブラリーに対するトラッピングにはより厳しい条件検討が必要であることが判明した。さらに、ILKAPホスファターゼについても、ILKAPの高精製度標品を調整しSubstrate Trappingを実施中である。脱リン酸化活性測定により、ILKAPについても亜鉛イオンが存在する場合脱リン酸化活性が抑制されることを明らかにした。また、ILKAPの細胞内解析のために、緑色蛍光タンパク質VenusとILKAPとの融合タンパク質とTet-on発現システムを同時に持つコンストラクトをCRISPR-Cas9法によるゲノム編集によって作製し、これを用いてVenus-ILKAPおよびILKAP-Venus発現H1299株の樹立に成功した。
|
