| 研究課題/領域番号 |
15K12749
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
谷田 以誠 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (30296868)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | オートファジー / ミトコンドリア / マイトファジー / タンパク分解 / GFP / pHluorin / pH感受性 / 神経変性疾患 |
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| 研究実績の概要 |
疾患に関与するオルガネラ選択的オートファジーの重要性が注目されており、オルガネラ選択的オートファジーをリアルタイムでモニターする測定系の開発が急務である。我々は、酸性pHに高い感受性を示す緑色蛍光蛋白質pHluorinを用いて、ミトコンドリア障害性環境因子により引き起こされる、マイトファジー（ミトコンドリア特異的オートファジー）をモニターできるプローブを作成し、評価する事を目的とした。当初、我々はpHluorin-mKate2タンデム蛍光タンパク質にミトコンドリア局在シグナルをもたせたプローブ, PK-mito, の発現プラスミドを作成したが、PK-mitoタンパク質は細胞内で分解産物が多く認められ、細胞全体に分布した像が多く認められたため、マイトファジーをモニターするプローブには適さないと判断した。ミトコンドリア局在シグナルをpHluroinあるいはmKate2に持たせた, pHluorin-mito（緑色蛍光）および mKate2-mito（赤色蛍光）は、分解産物も殆ど無く、蛍光顕微鏡観察によってもミトコンドリアに局在するパターンが認められたため、pHluorin-mitoとmKate2-mitoの発現量比が一定であれば、マイトファジーを観察できる測定系へと応用できる。そこで、バイシストロニック発現ベクターを作成し、単一mRNAから２種類のタンパク質（pHluorin-mitoとmKate2-mito）を発現させることにした。その結果、蛍光顕微鏡観察によりpHlurion-mitoとmKate2-mitoのそれぞれ緑色と赤色蛍光が観察され、両方共ミトコンドリア局在パターンを示した。今後、このプローブを用いて、マイトファジーが観察できるかどうかを検討していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初は、われわれが作成していたpH感受性緑色蛍光タンパク質pHluorinとpH安定性遠赤色蛍光タンパク質mKate2との融合タンパク質(PK-probe)を、ミトコンドリアに局在させようと計画したが、細胞内分解を受けやすいこと、蛍光シグナルが細胞質に多く分布することから、PK-probeがマイトファジーのモニター系に使えないことが判明した。これは予想外のできごとであった。そこで、発想を転換して、２種類のタンパク質を出来るだけ等しい比率で発現させることで、問題点を解決した。そのために当初予定より遅れてしまった。同時に計画していたペルオキシソーム局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製は順調であったが、リソソーム局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製と小胞体局在局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製は細胞内に発現させた時に分解産物が認められたので、今後検討していく。 また、脂肪滴局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製については、まだ成功していない。
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| 今後の研究の推進方策 |
マイトファジーのモニター系は今年度中に測定系の確立を優先して進めていく。ペキソファジーそ評価系についても着手する予定である。リソソーム局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製と小胞体局在局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製、脂肪滴局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製については、引き続き検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、われわれが作成していたpH感受性緑色蛍光タンパク質pHluorinとpH安定性遠赤色蛍光タンパク質mKate2との融合タンパク質(PK-probe)を、ミトコンドリアに局在させようと計画したが、細胞内分解を受けやすいこと、蛍光シグナルが細胞質に多く分布することから、PK-probeがマイトファジーのモニター系に使えないことが判明した。これは予想外のできごとであった。そこで、発想を転換して、２種類のタンパク質を出来るだけ等しい比率で発現させることで、問題点を解決した。そのために当初予定より遅れてしまったためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
マイトファジーのモニター系は今年度中に測定系の確立を優先して進めていく。ペキソファジーそ評価系についても着手する予定である。リソソーム局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製と小胞体局在局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製、脂肪滴局在pHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質の作製については、引き続き検討していく。
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