オルガネラ選択的オートファジーの新奇可視化法の開発

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K12749
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 谷田 以誠 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (30296868)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: マイトファジー / オートファジー / ペキソファジー / タンパク質分解 / ミトコンドリア / ペルオキシソーム / pHluorin

研究実績の概要

オートファジーは細胞内バルク分解システムで、多くの疾患、老化などに関与している。申請者らは、オートファジーの中でも、オルガネラ特異的オートファジーを検出する系の確立をめざした。パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患に深く関与するマイトファジー（ミトコンドリア特異的オートファジー）をリアルタイムでモニターする測定系の開発については、その研究の過程で、これまでミトコンドリア局在シグナルとして用いていたチロクロームcオキシダーゼのサブユニットの標的シグナルでは、pHluorinのミトコンドリア局在が発現量によって、leakyになることがわかってきた。そこで、ミトコンドリア局在シグナルを検討し、リステリア　モノサイトゲネシスのActAのミトコンドリア局在シグナルを用いることで、この問題が解決できることがわかり、発現ベクターの作り変えをおこなった。
もう一つの標的オルガネラとしてのペルオキシソームについては、昨年度、我々はpHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質に、ペルオキシソーム局在配列をつけペルオキシソームに局在する場合には、緑色・赤色の２重蛍光を発し、酸化ストレス等によりペキソファジーが誘導された場合にはペルオキシソームがオートファゴソームに取り囲まれ、リソソームに融合した時点で赤色蛍光のみを示すことで、ペキソファジー（ペルオキシソーム特異的オートファジー）を可視化・モニターできるプローブを作成した。これも発現量が多すぎると細胞質に分布してしまう問題点が見つかってきた。このため、発現量をコントロールできるTet-onシステムを導入し、ドキシサイクリン依存性に発現量をコントロールできるベクターを作成した。これについては、現在、どのくらいの発現誘導がペキソファジー測定に適しているかを検討している。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

マイトファジー（ミトコンドリア特異的オートファジー）をリアルタイムでモニターする測定系の開発については、その研究の過程で、これまでミトコンドリア局在シグナルとして用いていたチロクロームcオキシダーゼのサブユニットの標的シグナルでは、pHluorinのミトコンドリア局在が発現量によって、leakyになることがわかってきた。そこで、ミトコンドリア局在シグナルを検討し、リステリア　モノサイトゲネシスのActAのミトコンドリア局在シグナルを用いることで、この問題が解決できることがわかり、発現ベクターの作り変えをおこなった。これにより、細胞質に分布する問題はかなり改善された。
ペキソファジーの測定系については、これも発現量が多すぎると、細胞質に分布してしまう問題点が見つかってきた。このため、発現量をコントロールできるTet-onシステムを導入し、ドキシサイクリン依存性に発現量をコントロールできるベクターを作成した。これについては、現在、どのくらいの発現誘導がペキソファジー測定に適しているかを検討している。

今後の研究の推進方策

マイトファジープローブ、および、ペキソファジープローブどちらも、細胞内の発現量が一定の範囲でないと、定量化することが難しいため、安定発現ができる系を立ち上げないと、汎用的に多くの研究者が利用でき無いことが懸念される。このために、EBNA1-OriPエピゾーマル型ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびSleeping Beautyなどのトランスポゾン用ベクターを作成し、どの実験系が良いかを検討している。
今年度中に、これらの成果をまとめて、学会・論文発表すると共に、研究ツールとして、DNAバンク等を利用して、多くの研究者に供与できるようにする予定である。

次年度使用額が生じた理由

マイトファジープローブ、および、ペキソファジープローブどちらも、細胞内の発現量が一定の範囲でないと、定量化することが難しいため、安定発現ができる系を立ち上げないと、汎用的に多くの研究者が利用でき無いことが懸念される。このために、EBNA1-OriPエピゾーマル型ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびSleeping Beautyなどのトランスポゾン用ベクターを作成し、どの実験系が良いかを検討している。このために、実験計画の変更を要し。条件検討などに必要な試薬等の消耗品として使用する計画である。
また論文発表、学会発表も計画しており、そのためにも使用する計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Optimization of mNeonGreen for Homo sapiens increases its fluorescent intensity in mammalian cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanida-Miyake E, Koike M, Uchiyama Y, Tanida I.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 13 ページ: e0191108
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0191108
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular mechanisms of Streptococcus pneumoniae-targeted autophagy via pneumolysin, Golgi-resident Rab41, and Nedd4-1-mediated K63-linked ubiquitination. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ogawa M, Matsuda R, Takada N, Tomokiyo M, Yamamoto S, Shizukusihi S, Yamaji T, Yoshikawa Y, Yoshida M, Tanida I, Koike M, Murai M, Morita H, Takeyama H, Ryo A, Guan JL, Yamamoto M, Inoue JI, Yanagawa T, Fukuda M, Kawabe H, Ohnishi M.
  • 雑誌名: Cell Microbiol 巻: 26 ページ: e12846
  • DOI: 10.1111/cmi.12846
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Atg9a deficiency causes axon-specific lesions including neuronal circuit dysgenesis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi J, Suzuki C, Nanao T, Kakuta S, Ozawa K, Tanida I, Saitoh T, Sunabori T, Komatsu M, Tanaka K, Aoki S, Sakimura K, Uchiyama Y.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 17 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1080/15548627.2017.1314897
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] pHluorinを用いたオートファジー評価法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 谷田 以誠
  • 学会等名: 第123回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] ペキソファジー高感度可視化方法の分子基盤の確立 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷田 以誠、上野 隆、小池 正人
  • 学会等名: ConBio2017 (2017年度生命科学系学会合同年次大会)
• [備考] Google Scholar: Isei Tanida
  • URL: https://scholar.google.co.jp/citations?user=C9H0DzcAAAAJ&hl=ja&oi=ao