| 研究課題/領域番号 |
15K12763
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本間 さと 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任教授 (20142713)
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| 研究分担者 |
織田 善晃 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (20735542)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生体リズム / 転写調節 / 発光イメージング / インビボ計測 |
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| 研究実績の概要 |
自由行動下のマウス脳からの遺伝子発現、神経活動どを自発行動リズムと同時に計測することで、背後に想定される共通する脳内振動メカニズムを明らかにすることを目指し、中枢時計の局在する視交叉上核（SCN）と嗅球の2か所から時計遺伝子発現リズムを1分毎に自発活動と同時連続測定し、両部位における概日周期とウルトラディアン周期を検討した。
時計遺伝子Per1発現、PER2レベル、Bmal1発現は、いずれも、約3時間のウルトラディアン周期を示し、概日周期、ウルトラディアン周期のいずれも、SCNと嗅球で本質的な差異を認めなかった。両周期とも脳内の広い範囲で共通するメカニズムである可能性と、脳内の特定部位の振動体から脳全体に同一周期のリズムを駆動している可能性が考えられる。ウルトラディアン周期は活動期と休息期で著変がなく、3遺伝子はいずれも概日周期のピーク時に振幅が有意に増大した。このためウルトラディアン振動は概日時計によりAmplitude modulationを受けていることが分かった。また、SCN内の振動細胞間同期が低下するVIP受容体欠損マウス、および行動リズムが完全に消失するSCN破壊マウスを用い、自由行動下マウスの嗅球よりPER2リズムを計測した。同時に嗅球のスライス培養を行い、ex vivo, in vitroのリズムを比較した。その結果、嗅球スライス培養系では、SCNからの情報は欠如しているにも関わらず、安定した概日リズムが持続し、ウルトラディアンリズムはみられなかったが、リズム位相は、組織採取時刻によってリセットされていた。一方、SCN破壊マウスのin vivoでのPER2リズムは、非常に不安定であり、2週間以上の連続測定の経過で、概日周期が出現、消退を繰り返す例が多かったことから、in vivoでは、SCNからの同期シグナルが重要であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
時計遺伝子発現の概日振動とウルトラディアン振動が3遺伝子に共通して存在し、視交叉上核、嗅球とも、ほぼ同様のリズムを示すことが明らかにした。また、嗅球の末梢時計は、培養操作でリズムがリセットされる発見は驚きであり、培養系では内因性位相が推定できないことを明らかにした。位相を調べるにはin vivoでの測定が必須であり、本システムの重要性を示すことができた。また、スライス培養では、安定したリズムを示す嗅球が、SCN破壊動物では、極めて不安定で概日周期がほとんど見られないことも、培養下の組織における時計機構形成と、生体内での中枢時計による制御の重要性を対比させる結果となり、ex vivoとin vivoの差異を別の方向から示す結果となった。これらの成果は、２つの論文に発表することができ、反響も大きかった。一方、マルチユニット活動との同時計測については、セットアップは順調に進んだものの、長期の低ノイズの計測にはまだ問題がある。予測以上の成果を上げた点と、予定通りの成果が未だ得られていない点の両方があることから、おおむね順調な結果と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
視交叉上核における概日振動とウルトラディアン振動体の関係を示す平成27年度の成果は、各遺伝子が、それぞれの概日リズムのピーク時にウルトラディアンリズムの振幅が上昇するため、各時計遺伝子発現のピーク時に転写の振幅が増大するメカニズムが存在することを示唆する。そこで、今後は、概日リズムが時計遺伝子転写のウルトラディアンリズム振幅を変化させるメカニズムを検討すると共に、懸案であるマルチユニット活動との同時計測を進め、視交叉上核内外での概日リズム位相の逆転、行動が視交叉上核の電気活動を抑制するか亢進させるか、その変化が結果か原因かなどの、未だ未解決の問題点を、自由行動下でのin vivo計測により明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
光ファイバーを用いた研究については、成果がまとまったため、論文作成を急いだ。論文投稿後、追加実験、追加解析を要求された。このため、すでにセットアップ済みの機器を用い、追加実験を行うと共に、大量のデータのリズム解析に時間が取られた。光ファイバーを用いた実験は、プラスチック製光ファイバーが極めて安価で再利用が可能であること、解析法の開発には時間はかかるものの経費がほとんどかからないこと、などの理由により、本年度予算に余剰が出た。成果はすでに2報の論文にまとまり、さらに、次の論文も投稿準備をしている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
遺伝子発現と電気活動の同時計測を進め、野生型に加え、各種遺伝子改変動物における遺伝子発現、神経活動リズムと、自発行動リズムとの関係を検討するため、繁殖の困難な遺伝子改変動物含めた各種発光レポーターマウスを十分数飼育する。光パルスに対する反応性の計測のため光照射装置とシャッタ―とを連動させ、中枢時計の位相変位と電気活動への出力、自発行動リズムの変化を同一個体で計測する。このため、平成27年度に節約の結果生じた余剰金と平成28年度予算を加えた2,512,318円については、専用の防音・温度湿度の調節されたin vivo計測のための動物実験室使用料（78万円/年）、動物飼育経費（48万円）、技術補助員謝金(週3日、512400円/年)、電極、試薬（ルシフェリン他）、電気生理学用部品等の物品費（50万円）、学会における発表・情報収集(名古屋往復3泊、10万円)、論文掲載（14万円）に使用の予定である。
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