結晶格子を利用したタンパク質結晶化支援タグの開発

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K13747
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 真板 宣夫 徳島大学, 先端酵素学研究所(次世代), 准教授 (00404046)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: タンパク質結晶化

研究実績の概要

28年度は本研究の可能性を探りつつ、論文としてまとめる着地点を探ることにした。
まずR1Bm-ENとその融合タンパク質の発現を確認する目的で、R1Bm-ENに対する抗体作製を外注で依頼した。この抗体で大腸菌全抽出液を免疫染色したが、多少の非特異的なバンドも見られたものの精製の確認においては問題ないものが得られた。
前年度までの結果を受け、R1Bm-ENのＣ末22残基を削ったFAM3CおよびMETTL7Bを融合させたコンストラクトを作製した。コドン使用頻度を至適化した大腸菌（Rosetta2）でタンパク質の発現を確認したところ、発現量は極めて低かった。このため、高分子量のタンパク質については一旦保留し、この手法の知財化および低分子量タンパク質に絞ってまとめることにした。この手法がＮ末に融合させた場合でも有効かどうか確かめるため、SUMO、hHR23のUIMドメインをＮ末に融合させたものを構築し、発現、精製を試みた。SUMOを融合させたものは、タグを除去した後ほとんど沈殿してしまい結晶化に至らなかったが、UIMを融合させたものは精製することが出来て、現在結晶化を行っているが、まだ結晶は得られていない。また、R1Bm-ENが凝集しやすいのを改良するため、タンパク質表面に存在する２個のシステイン残基をセリン残基に置換した変異体も作製したが、凝集のしやすさは改善しなかった上に、プロテアーゼによるタグの切断が全く切れなくなってしまった。
これと並行して、大学知財部門に依頼してこの手法の特許を出願した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当初計画していた高分子量タンパク質について、精製の段階で上手くいかないという想定外の事態が起こってしまった。また、精製で使用するHPLCが故障で２カ月使用できず、実験計画に遅れが生じてしまった。

今後の研究の推進方策

当初は研究期間は２年間であったが、２９年度までの延長を申請した。２９年度は論文発表を行い、次の外部資金獲得につなげていく。
課題開始後実際に実験を行ってみた結果、高分子量で構造未知タンパク質の構造決定という当初の目標がいくらか高すぎたように感じられるので、その前段階の研究（例えば機能既知だが高分子量タンパク質）をまずしっかり行って、データを積み上げていくようにしていく。

次年度使用額が生じた理由

平成28年10月に、精製に必須なHPLC装置が故障し12月に修理を行ったため、この期間中のタンパク質精製が行えなかった。またこの影響で、11月下旬の放射光施設でのビームタイムで予定していたＸ線回折データを取ることが出来なかった。計画していた海外出張を取りやめ、特許出願費用は大学の知財部門が負担したため、その分をHPLC装置の修理に充てたが残金が発生した。

次年度使用額の使用計画

研究計画の遅れにより、研究期間内に論文発表することが出来なかったので、論文執筆および投稿にかかる諸費用（英文校正、投稿料、掲載料など）に用いる他、追加実験に必要な試薬類に使用する。

備考

徳島大学 教育研究者総覧
http://pub2.db.tokushima-u.ac.jp/ERD/person/166156/profile-ja.html

研究成果

• [雑誌論文] Protease-resistant modified human β-hexosaminidase B ameliorates symptoms in GM2 gangliosidosis model (2016)
  • 著者名/発表者名: Keisuke Kitakaze, Yasumichi Mizutani, Eiji Sugiyama, Chikako Tasaki, Daisuke Tsuji, Nobuo Maita, Takatsugu Hirokawa, Daisuke Asanuma, Mako Kamiya, Kohei Sato, Mitsutoshi Setou, Yasuteru Urano, Tadayasu Togawa, Akira Otaka, Hitoshi Sakuraba, Kohji Itoh
  • 雑誌名: The Journal of Clinical Investigation 巻: 126 ページ: 1691 1703
  • DOI: 10.1172/JCI85300
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 高病原性インフルエンザウィルス感染に関わる宿主酵素MSPLとペプチド性阻害剤の複合体結晶構造 (2016)
  • 著者名/発表者名: 43.真板綾子, 真板宣夫, 奥村裕司, 永野ひかる, 次田早希, 有田恭平, 坂東亜紀, 田畑考統, 平坂勝也, 安倍知紀, 近藤茂忠, 二川健
  • 学会等名: 第16回蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場、福岡県福岡市
  • 年月日: 2016-06-09 – 2016-06-09
• [産業財産権] 1.多孔性タンパク質結晶を利用したタンパク質結晶化 (2017)
  • 発明者名: 真板 宣夫
  • 権利者名: 徳島大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2017-042456
  • 出願年月日: 2017-03-07