|
近年、質量分析器の高性能化にともないタンパク質・ペプチドの網羅的解析が広く行われるようになってきており、様々な疾患のマーカータンパク質やタンパク質のリン酸化状態の定量が試みられている。質量分析器は、多くのタンパク質をノンバイアスに検出・同定することが可能である点で優れているが、その性質上、試料中に微量しか存在しないタンパク質の感度が悪いことが問題であり、その解決策が求められてきた。
これまでは、微量のタンパク質の濃縮にはその抗体を用いるか、リン酸化などを指標にアフィニティー精製による濃縮を行ってきたが、狙ったタンパク質、特定の修飾されたものしか見えないという制約があり、質量分析のノンバイアス性を活かしきれていなかった。本研究ではタンパク質の吸着能の比較的低い濾紙に電気泳動によって分離させたタンパク質を転写させ、存在量の多いタンパク質のメンブレンへの吸着量を制限することで、タンパク質量の分布をある程度均一化することに成功した。しかし、吸着させたタンパク質は微量であるため、下流の酵素消化から質量分析に用いるためには効率の良い回収条件の選定が必要であることがわかった。そこで、はじめにタンパク質をトリプシンなどのエンドプロテアーゼを用いて、ペプチド断片にしてから静電相互作用を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる分画と、C18による疎水性相互作用による分画を行うことで、タンパク質の多様性の向上と分画による標的タンパク質フラグメント（ペプチド）の純度を高め、微量タンパク質の高感度な質量分析を達成した。これを絶対定量法であるMS-QBiC法と組み合わせることで、１細胞内に数千分子しか存在しない転写因子の増減を定量的に検出することに成功した。（Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jun 14;113(24):E3461-7）
|
