| 研究課題/領域番号 |
15K13751
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
川上 隆史 山梨大学, 総合研究部, 助教 (60638881)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ホスホノペプチド / PUREシステム / 分子進化 / ホスホン酸 / リボザイム / リボソーム / アミノホスホン酸 / 抗体 |
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| 研究実績の概要 |
リボソームはエステル結合やチオエステル結合の形成を触媒可能であることが知られているが（Ellman et al., Science 197, (1992)）、カルボン酸以外の酸基質を触媒した例は報告されていない。そこで本研究ではアミノ酸のカルボキシル基の代わりにホスホニル基を持つアミノホスホン酸tRNAに連結し、リボソーム内でホスホノペプチド結合（リンー窒素間の結合）の形成を触媒可能であるか検証することを目的とする。
昨年度、HPLCによるO-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステルの反応性解析を行い、ランダムRNAライブラリーからのtRNAアミノホスホニル化リボザイムの分子進化実験を実行した。定量PCR解析の結果、固定化ストレプトアビジンへの回収率の上昇を観察することができた。
本年度は、まず、回収率の上昇が観察されたRNAライブラリーのクローニングおよび配列解析を行なった。その結果、数種類のRNAへの配列収束を観察することができた。また、各クローンRNAについて、O-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステルの反応、および、アミノ基選択的ビオチン化を介した、固定化ストレプトアビジンの高い回収率での回収、ならびに、ストレプトアビジン依存的ゲルシフトアッサイによるバンドのシフトを観察することもできた。更に、最も高い回収率とゲルシフト率を示したクローンRNAについて、その反応は、O-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステル依存的、かつ、RNA3'末端のジオール構造依存的であることも判明した。従って、O-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステルを基質として、tRNAドメインの3'末端のジオール選択的にアミノホスホニル化を触媒する新規リボザイムの同定に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
数種類のRNAへの配列収束を観察し、かつ、各クローンRNAについて、O-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステルとの反応を、プルダウンアッセイ、ならびに、ゲルシフトアッサイにより確認することに成功したため。
O-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステルを基質として、tRNAドメインの3'末端のジオール選択的にアミノホスホニル化を触媒する新規リボザイムの同定に成功したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
同定した新規アミノホスホニル化リボザイムについて、O-メチル-ホスホン酸-3,5-ジニトロベンジルエステルによる、tRNAの3'末端ジオールへのアミノホスホニル化が、様々なtRNA種について、分子間で進行することを確認する。また、調製したアミノホスホニルtRNAと再構築型無細胞翻訳系（PUREシステム）を用いて、リボソーム内でホスホノペプチド結合（リンー窒素間の結合）の形成を触媒可能であるか検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度異動した先である新所属機関（山梨大学）において、より多くの共通機器が利用可能となったため、計画よりも研究費を抑えることが可能となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
引き続き、有機合成化学実験試薬・器具、生化学実験試薬・器具などの物品費、学会発表のための旅費等として使用する計画である。
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